30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Bakteri Sumber Gen
Bakteri yang dipilih sebagai bakteri sumber gen adalah L.pentosus yang diperoleh dalam bentuk wild type NITE-BRC, Jepang. Bakteri tersebut merupakan kelompok
Bakteri Asam Laktat BAL yang memiliki perangkat gen terkait dengan metabolisme gula heksosa maupun pentosa. Pada organisme ini, tiga jenis gen terlibat dalam
katabolisme D-xilosa, menyandikan enzim D-xilosa isomerase xylA, D-xilosa kinase xylB
, dan protein regulator xylR. Untuk mengetahui sekuens DNA dan asam amino dari bakteri sumber gen maka dilakukan penelusuran melalui pendekatan bioinformatika
yang dilengkapi dengan perangkat internet online, yaitu dengan menggunakan data Genebank
yang diakses secara bebas dari website NCBI National Center for Biotechnology Information
pada situs http:www.ncbi.nlm.nih.gov BLAST.
Gambar 3. Sekuens nukleotida gen xylA dari L.pentosus
31
Gambar 4. Sekuens asam amino yang disandikan oleh gen xylA
Pemilihan bakteri L.pentosus sebagai bakteri sumber gen juga karena bakteri ini tidak bersifat patogen dan telah direkomendasikan secara umum memiliki status GRAS
Bacteria Generally Recognized As Save Bacteria artinya suatu bakteri yang aman untuk
digunakan. Berdasarkan data yang diberikan dari Genebank dapat diketahui gen xylA mempunyai panjang 1350 pasangan basa Gambar 3 dan menyandikan 450 asam amino
Gambar 4.
4.2. Isolasi Genom
Isolasi genom menggunakan bahan-bahan Genomic DNA Purification Kit dari Fermentas. Isolasi genom diawali dengan penghancuran dinding sel, pemusnahan protein,
dan juga RNA sehingga hanya tertinggal DNA dalam bentuk murni. L.pentosus merupakan bakteri gram positif, yang memiliki kandungan peptidoglikan yang lebih tebal
pada dinding selnya dan untuk menghancurkannya maka dilakukan secara kimiawi yaitu dengan memanfaatkan lisozim yang berasal dari putih telur, karena lisozim dapat
mendigesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan dinding sel, kemudian lisis disempurnakan dengan penambahan larutan lysis solution Kits Fermentas berfungsi
32
untuk menghilangkan ion magnesium yang penting dalam mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel serta untuk menghambat kerja enzim selular yang dapat merusak
DNA, dan untuk membantu menghilangkan molekul lipid. lysis solution mengakibatkan sel mengalami lisis. Pecahan debris sel yang timbul dibersihkan dengan cara
sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida DNA dan RNA. Untuk mendapatkan kemurnian yang tinggi dari DNA yang dihasilkan, tahap yang paling
penting adalah penghilangan molekul pengotor yang tidak diinginkan. Protein yang merupakan pengotor utama dalam ekstraksi DNA dari bakteri dihilangkan dengan
penambahan kloroform yang dapat menyebabkan presipitasi protein, namun DNA dan RNA tetap masih ada. Selanjutnya untuk mendapatkan DNA yang murni, maka harus
menghilangkan RNA dengan menggunakan enzim RNAse yang dapat memecah molekul RNA menjadi subunit ribonukleotida.
Berdasarkan data yang diperoleh dari Genebank, ukuran genom L.pentosus belum diketahui secara keseluruhan. Perkiraan kasar ukuran genom dilakukan dengan
elektroforesis menggunakan gel agarosa yang divisualisasi di bawah sinar UV setelah pewarnaan Et-Br. Posisi pita isolat genom L.pentosus berada pada ukuran di atas 10.000
pb ukuran marker. Genom ini membentuk konformasi superkoil, sehingga molekul- molekul DNA pada genom mudah dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa karena
mempunyai mobilitas yang tinggi Watson, et al. 1992.
33
Gambar 5. Hasil isolasi genom, M GeneRuler 1 Kb DNA Ladder Marker; S1S2 Isolat genom L.pentosus
Terlihat pada gambar 5, isolat genom S2 memiliki intensitas lebih tebal dibandingkan dengan isolat genom S1, maka isolat genom S2 yang selanjutnya
digunakan sebagai DNA cetakan pada proses amplifikasi DNA target dengan metode PCR.
4.3. Ampilifikasi DNA Target xylA dengan PCR
Kategori