Gambar 5. Hasil isolasi genom, M GeneRuler 1 Kb DNA Ladder Marker; S1S2 Isolat genom L.pentosus
Terlihat pada gambar 5, isolat genom S2 memiliki intensitas lebih tebal dibandingkan dengan isolat genom S1, maka isolat genom S2 yang selanjutnya
digunakan sebagai DNA cetakan pada proses amplifikasi DNA target dengan metode PCR.
4.3. Ampilifikasi DNA Target xylA dengan PCR
Proses PCR menggunakan DNA cetakan hasil dari isolasi genom dan menggunakan komponen PCR Kits Fermentas. Primer yang digunakan dalam PCR ada
dua macam yaitu primer forward dan primer reverse. Agar memperoleh produk PCR yang spesifik maka dilakukan analisa pada kedua primer tersebut dengan menggunakan
Software Bioinformatika Genamics Expression, BioEdit versi 7.04 dan DNA Calculator
dengan parameter – parameter tertentu Lampiran 6, 7 dan 9 dan penambahan situs enzim restriksi yang akan digunakan, maka dipilih pasangan primer terbaik yaitu :
1. Primer forward : 5’ GGATCCTATGACGAATGAGTATTGGCAAGG 3’ 2. Primer Reverse : 5’ TCTCGAGCTTGCTTAACGTCTC 3’
34
Pada primer forward ditambahkan situs pemotongan enzim restriksi BamHI G GATCC, sedangkan pada primer reverse ditambahkan situs pemotongan enzim
restriksi XhoI CTC GAG. Kedua enzim tersebut dipilih karena diketahui tidak memotong sekuens gen xylA dari L.pentosus Lampiran 7. Hasil uji in silico kedua
primer tersebut dengan software FastPCR menunjukkan hasil produk PCR dengan panjang 1361 pb Lampiran 8.
Pada penelitian ini satu siklus PCR terdiri atas tiga tahapan, yaitu denaturasi, annealing
dan ekstensi. Pradenaturasi dilakukan selama 2 menit dan pada suhu 94
o
C sebanyak satu kali. Untuk tahap denaturasi dilakukan selama 30 detik pada suhu 94
o
C, tahap annealing dilakukan selama 30 detik pada suhu 52
o
C , dan tahap ekstensi dilakukan selama 1 menit pada 72
o
C. Jumlah siklus yang dilakukan adalah 35 siklus. Pada siklus terakhir dilakukan pemanjangan waktu ekstensi selama 7 menit. Penentuan utama
keberhasilan proses amplifikasi gen biasanya adalah suhu annealing, yaitu suhu saat primer melekat pada DNA cetakan, sedangkan suhu denaturasi dan ekstensi pada
umumnya tetap. Penetapan suhu annealing secara teoritis biasanya 5-10
o
C dibawah nilai suhu leleh Temperatur Melting, Tm dari kedua primer. Produk PCR ditunjukkan pada
gambar berikut :
Gambar 6. Hasil amplifikasi gen xylA dengan reaksi PCR
35
Dari gambar 6 terlihat bahwa amplifikasi gen xylA dengan reaksi PCR telah berhasil dilakukan dan ditunjukkan dengan adanya pita spesifik yang terletak pada
ukuran di antara 1000 pb dan 1500 pb. Pita yang tampak pada gambar 6 merupakan produk PCR, hasil ini diprediksi merupakan pita gen xylA dari L.pentosus. Hasil PCR ini
sesuai dengan prediksi menggunakan software FastPCR in silico Lampiran 8 yaitu dengan panjang 1361 pb, kemudian selanjutnya dilakukan purifikasi dengan
menggunakan Gel Extraction Kit dari Bio Basic Inc.
4.4. Ligasi dan Transformasi
