Dari gambar 6 terlihat bahwa amplifikasi gen xylA dengan reaksi PCR telah berhasil dilakukan dan ditunjukkan dengan adanya pita spesifik yang terletak pada
ukuran di antara 1000 pb dan 1500 pb. Pita yang tampak pada gambar 6 merupakan produk PCR, hasil ini diprediksi merupakan pita gen xylA dari L.pentosus. Hasil PCR ini
sesuai dengan prediksi menggunakan software FastPCR in silico Lampiran 8 yaitu dengan panjang 1361 pb, kemudian selanjutnya dilakukan purifikasi dengan
menggunakan Gel Extraction Kit dari Bio Basic Inc.
4.4. Ligasi dan Transformasi
Produk PCR xylA diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy yang mengandung gen lacZ membentuk plasmid rekombinan pGxylA, kemudian ditransformasikan ke
dalam bakteri inang E.coli DH5 . Ligasi dilakukan dengan mencampurkan sekuen gen yang akan disisipkan dengan plasmid dengan perbandingan molar 3:1 Lampiran 3.
Untuk mengetahui efisiensi transformasi digunakan kontrol transforman berupa plasmid sirkular utuh yang tidak terpotong. Sel kompeten E.coli DH5 disisipkan dengan
menggunakan metode CaCl
2
. Transformasi dilakukan dengan metode Heat Shock kejut panas, yaitu dengan melakukan perubahan suhu secara ekstrim. Metode ini dipilih
karena prosesnya lebih mudah dan efisien, ketika kejut panas dilakukan, membran sel yang pada awalnya dalam keadaan dingin akan menjadi tidak selektif ketika terjadi
lonjakan panas sehingga menyebabkan plasmid dapat masuk ke dalam bakteri.
36
A B
C Gambar 7. A kontrol positif terhadap E.coli DH5 yang terinsersikan plasmid kosong,
B kontrol negatif terhadap E.coli DH5 , C Transforman bakteri rekombinan
Proses transformasi kali ini menggunakan kontrol transformasi yaitu kontrol positif terhadap E.coli DH5 yang tersisipkan plasmid kosong dan kontrol negatif
terhadap E.coli DH5 yang tidak tersisipkan plasmid. Keberhasilan transforman dapat dilihat pada gambar 7A dan 7C dengan tumbuhnya koloni pada media LB padat yang
telah mengandung ampisilin. Hal ini dikarenakan, plasmid yang digunakan memiliki gen resistensi terhadap ampisilin, sehingga yang dapat tumbuh adalah hanya sel yang tersisipi
plasmid. Sedangkan E.coli DH5 yang tidak tersisipkan plasmid ditunjukkan pada gambar 7B, tidak dapat tumbuh pada media LB yang telah mengandung ampisilin.
Bakteri rekombinan yang mengandung plasmid pGxylA yang tumbuh, kemudian ditumbuhkan pada media seleksi, yaitu media LB padat dengan penambahan antibiotik
ampisilin, IPTG dan X-Gal. Adanya X-Gal dan IPTG akan menghasilkan koloni biru dan putih. Koloni bakteri yang putih diisolasi karena mengandung pGEM-T Easy
rekombinan. Bakteri yang mengandung pGEM-T Easy rekombinan tidak mampu menghasilkan –galaktosidase karena gen lacZ telah rusak akibat tersisipi oleh fragmen
gen xylA, sehingga X-Gal tidak dapat diuraikan dan koloni tetap berwarna putih, sedangkan koloni yang mengandung pGEM-T Easy non rekombinan akan berwarna biru
37
karena gen lacZ yang menyandikan -galaktosidase masih aktif dan mengubah substrat X-Gal yang tidak berwarna menjadi biru.
4.5. Isolasi Plasmid
