larutan hematoksilin selama 3-7 detik kemudian preparat jaringan dialiri air mengalir air ledeng selama 10 menit dan dicuci aquades sebentar.
Pewarnaan hematoksilin telah selesai dan akan dilanjutkan ke pewarnaan eosin 0,5 dalam alkohol 70, selanjutnya setelah jaringan dicuci aquadest,
dimasukkan di dalam larutan-larutan alkohol bertingkat dengan konsentrasi meningkat 30, 50, 80, 70, 80, 95, 100 selama 1 menit
kemudian dimasukkan ke dalam larutan eosin 0,5 dalam alkohol 70 selama 1-3 menit. Preparat jaringan selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan-larutan
alkohol bertingkat dengan konsentrasi meningkat 70, 80, 96, 100, selama 1 menit selanjutnya dimasukkan ke dalam xilol sebanyak 3 x masing-
masing selama 5 menit, lalu ditutup dengan cover glass menggunakan media mounting kanada balsam, jaringan diamati di bawah mikroskop Suntoro, 1983.
3.3.4 Metode Imunohistokimia
Preparat jaringan yang akan diuji imunohistokimia terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan xilol sebanyak 3 x masing-masing selama 5 menit,
kemudian preparat didehidrasi di dalam larutan-larutan alkohol bertingkat dengan konsentrasi menurun 100, 95, 80, 70, 50, 30, selama 1 menit dan dibilas
dengan aquades 2x1 menit dan dilakukan langkah antigen retrieval dengan metode pemanasan dalam larutan buffer sitrat Shi et al, 1991. Kemudian dibilas
dengan PBS, diinkubasi di suhu ruang dengan H
2
O
2
3 untuk memblok enzim endogen selama 7 menit, kemudian preparat dibilas dengan PBS, ditetesi dengan
larutan BSA 5, selanjutnya preparat ditetesi dengan antibodi primer IgY chicken anti-c-Myc dan diinkubasi semalaman pada suhu 8
o
C. Setelah inkubasi, preparat dicuci dengan akuabides, kemudian diinkubasikan lagi dengan antibodi sekunder
goat anti-chicken berkonjugat HRP pada suhu ruangan selama 30 menit, dicuci preparat dan ditetesi larutan kromogen DAB sambil diamati perubahan warna
yang terjadi pada jaringan di bawah mikroskop. Larutan DAB dibuat segera sebelum digunakan, dengan cara mencampurkan 5
µl DAB ke dalam 125 µl air bebas ion yang telah diberi 2
µl buffer asetat dan 3 µl H2O2 3. Untuk pewarna imbangan digunakan Hematoksilin Mayer. Selanjutnya dilakukan clearing dengan
cara merendam preparat di dalam xilol selama 2X 30 menit, lalu ditutup dengan
cover glass menggunakan media mounting kanada balsam. Jaringan diamati di bawah mikroskop dan diberi skor tingkat ekspresi semikuantitatif Kumar et al,
2009
3.3.5 Skoring
Penentuan tingkat ekspresi protein c-myc pada jaringan uterus dan ovarium dilakukan melalui pengamatan dan skoring jaringan di bawah mikroskop
cahaya. Sel-sel positif berwarna kecoklatan, sedangkan sel negatif berwarna biru ungu. Skoring dilakukan menggunakan lensa objektif perbesaran 100 kali. Tiap-
tiap jaringan diamati dan diberi skor tingkat ekspresi di tiga lapang pandang, aturan penilaiannya mengikuti Hamaguchi et al 1995: 1= ekspresi kurang dari
10 rendah ; 2 = ekspresi sedang sel positif antara 11 – 25 sedang ; 3 = ekspresi tinggi 26 – 50 tinggi ; 4 = ekspresi sangat tinggi, sel positif lebih dari
50 sangat tinggi Hamaguchi et al, 1995.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
