Template DNA Primer Oligonukleotida dNTPs deoxynucleotide triphosphates

primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Amplifikasi sekuen DNA target dapat memperoleh 10 6 -10 9 kali jumlah DNA target awal. Amplifikasi ini dapat menghasilkan lebih dari satu juta kali DNA asli Muladno 2010 Sudjadi 2008. Konsep teknologi PCR mensyaratkan bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dilakukan. Reaksi pelipat gandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template cetakan sehingga rantai DNA yang berantai ganda double stranded akan terpisah menjadi rantai tunggal single stranded. Denaturasi DNA dilakukan dilakukan dengan menggunakan suhu 95°C selama1 –2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55°C sehingga primer akan menempel annealing pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Suhu optimal untuk penempelan primer ± 55 °C. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah 37°C, tetapi biasanya akan terjadi mispriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah. Pada suhu yang lebih tinggi 55°C, spesifitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara keseluruhan efisiensinya akan menurun Yuwono 2006. Menurut Handoyo Rudiretna 2001 komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR secara umum adalah DNA template, sepasang primer, dNTPs deoxynucleotide triphosphates, buffer PCR, magnesium klorida MgCl dan enzim polimerase DNA.

a. Template DNA

Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA. DNA template diperoleh dengan melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid. Handoyo Rudiretna 2001. Konsentrasi template DNA harus dioptimasi. Jika konsentrasinya terlalu rendah, maka primer tidak dapat menemukan target. Sebaliknya bila konsentrasi template DNA terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan salah target mispriming. Selain itu kemurnian template DNA juga penting, karena dapat mempengaruhi hasil reaksi Zein Prawiradilaga 2013.

b. Primer Oligonukleotida

Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’-OH rantai DNA cetakan yang lain Yuwono 2006. Menurut Suryanto 2003, primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida. Semakin panjang primer, maka harus spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom kelompok tersebut.

c. dNTPs deoxynucleotide triphosphates

dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP deoksiadenosin trifosfat, dTTP deoksitimidin trifosfat, dCTP deoksisitidin trifosfat dan dGTP deoksiguanosin trifosfat. Pada proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. Pada proses ekstensi dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. Konsentrasi optimal dNTP untuk proses PCR harus ditentukan Handoyo Rudiretna 2001.

d. Buffer PCR dan MgCl