d. Elektroforesis Gel Agarose
Metode elektroforesis gel agarose digunakan untuk melihat keberhasilan amplifikasi PCR gen sitokrom oksidase I menggunakan primer forward dan
reverse berdasarkan laju migrasi fragmen DNA dalam gel agarose. DNA divisualisasi menggunakan elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1,5
gel agarosa. Setelah elektroforesis, DNA divisualisasi di dalam UV transiluminator. Hasil yang baik pada amplifikasi PCR dapat dilanjutkan pada
langkah selanjutnya yaitu sekuensing untuk melihat runutan nukleotida gen sitokrom oksidase I pada Bactrocera sp, B. cucurbitae dan B. papayae.
e. Sekuensing
Produk PCR yang baik dilanjutkan dengan tahap sekuensing. Sekuensing DNA dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotida pada daerah cox1.
Sekuensing dilakukan pada Lembaga Genetica science di Singapura.
f. Analisis Data
Data hasil sekuensing berupa ABI file dari Bactrocera sp, Bactrocera papayae dan Bactrocera cucurbitae dilakukan pengeditan secara manual
menggunakan program BioEdit Versi 7.0.9. Hasil pengeditan sekuen dimasukkan dalam BLAST Basic Local Alignment Search Tool NCBI untuk melihat
homologi dengan spesies terdekat. Pohon filogeni diperoleh dengan menggunakan metode neighbor-joining, dimana kalkulasi matrik jarak genetik
dengan model Kimura-2 parameter yang diimplementasikan pada pairwise distance calculation dengan Bootstrap 1000 ulangan dalam program MEGA
Molecular Evolutionary Genetics Analysis software Versi 6.0 Tamura et al. 2013. Sekuen sampel yang dibandingkan dengan beberapa koleksi GenBank
Bactrocera sp yang dianalisis oleh Zhang et al. 2010. Bactrocera sp yang digunakan dalam analisis ini berasal dari daerah yang berbeda-beda yang
disajikan pada Tabel 6 di bawah ini.
Tabel 6. Daftar spesies yang dianalisis. Nama spesies
Cox I Daerah asal
1 Anastrapha ludens
AB192462 Amerika
2 B.caudata
GQ458048 Asia
3 B.diaphora
GQ458043
Asia 4 B. papaya
DQ917578 Asia
5 B.philippinensis
DQ995281 Asia
6 B.scutellata
GQ458046 Asia
7 Bactrocera sp
Sampel
8 B. cucurbitae
Sampel
9 B. papayae
Sampel
10 B. cucurbitae_Prancis JX162208
Prancis 11 Bactrocera calumniate
GQ154808 Asia
12 B. cucurbitae
DQ116244 Asia
13 B.cucurbitae
DQ006875.1 Swiss
Ket: merupakan sampel dalam penelitian ini. Tanpa keterangan merupakan sampel koleksi dari GenBank.
30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori