analisis molekuler dilakukan pengawetan specimen dengan menyimpan imago Bactrocera sp dalam etanol murni. Larva instar tiga disimpan dalam alcohol 95
. Masing-masing awetan disimpan dalam frezer -20 C sampai spesimen
dibutuhkan untuk isolasi.
4. Identifikasi Bactrocera sp secara molekuler
Identifikasi molekuler
ketiga spesies
Bactrocera dilakukan
di Laboratorium Virologi Unniversitas Gadjah Mada. Analisis ini dilakukan
melalui beberapa langkah yaitu Isolasi DNA, elektoforesis DNA, reaksi berantai PCR, kemudian dielektoforesis kembali, dan yang terakhir metode sekuensing.
Berikut ini dijelaskan langkah-langkah analisis molekuler Bactrocera sp, B. cucurbitae dan B. papayae sebagai berikut.
a. Isolasi DNA
Isolasi DNA lalat buah menggunakan sampel yang berupa imago dan larva. Masing-masing jaringan sampel dilakukan isolasi DNA genom Bactrocera sp
berdasarkan protokol genomic DNA mini kit tissue yang tetera pada langkah
sebagai berikut: 1 Sampel imago Bactrocera sp diambil jaringan toraknya menggunakan pinset.
Jika menggunakan sampel larva, maka diambil larvanya. 2 Sampel ditimbang 30 mg dan dimasukan dalam tube
3 Sampel dihaluskan menggunakan micropestle 4 Pada proses penghalusan 200 µl GT Buffer ditambahkan pada sampel
kemudian dihaluskan kembali. 5 Sampel yang telah diahaluskan ditambahkan 20 µl Proteinase K dan
dihomogenkan menggunakan vortex. 6 Sampel diinkubasikan pada suhu 60°C selama 30 menit, selama inkubasi tube
di bolak-balik setiap 5 menit 7 Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 200 µl GBT Buffer dan
dihomogenkan menggunakan vortex selama 5 detik.
8 Sampel diinkubasikan kembali pada suhu 60°C selama 20 menit, selama diinkubasi tube di bolak-balik setiap 5 menit, pada proses ini Elution Buffer
dipanaskan 100 µl per sampel pada 60°C. 9 Sampel disentrifugasi pada 14.000-16.000 selama 2 menit
10 Sampel yang telah disentrifugasi diambil supernatannya sebanyak 1,5 ml dan dipindahkan pada tube baru.
11 Supernatan ditambahkan ethanol absolute sebanyak 200 µl dan di shaker selama 10 detik
12 GD kolom ditempatkan pada tube 2 ml 13 Cairan yang ada pada tube 1,5 ml dipindakan ke GD kolom, setelah itu
disentrifugasi pada 14.000-16.000 selama 2 menit 14 GD kolom yang telah disentrifugasi dipindahakn pada tube 2 ml yang baru
15 W1 Buffer sebanyak 400 ul ditambahkan pada GD kolom 16 GD kolom disentrifugasi 14.000-16.000 selama 30 detik, kemudian
dipindahkan tube 2 ml yang baru 17 600 µl Wash Buffer ditambahkan pada GD kolom dan disentrifuse kembali
pada 14.000-16.000 selama 30 detik 18 GD kolom dipindahkan pada tube 2 ml yang baru dan disentrifuse 14.000-
16.000 selama 3 menit 19 GD kolom dipindahkan pada tube 1,5 ml
20 100 µl Elution Buffer ditambahkan pada bagian tengah tube 21 GD kolom diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit dan disentrifugasi
14.000-16.000 selama 30 detik 22 GD kolom yang telah disentrifugasi dibuang, sedangkan tube pada suhu -
20°C-40°C.
Keberhasilan isolasi DNA ketiga sampel Bactrocera.sp, B. cucurbitae dan B. papayae dapat dilihat berdasarkan fragmen DNA yang bermigrasi pada gel
agarose.
b. Elektroforesis Gel agarose
