Pada tahun 1977 metode sekuensing telah berkembang di Amerika yang dipelopori oleh Maxam and Gilbert dan pada tahu 1974 di Inggris oleh Sanger.
Ada dua metode Sekuensing yaitu metode Maxam and Gilbert dan Sanger Lilian et al. 2002.
a. Metode Maxam and Gilbert
Metode ini didasarkan pada degradasi basa secara kimiawi. Pada metode ini DNA yang akan disekuensing ditandai dengan zat radioaktif. Fragment DNA
yang sudah dilabeli merupakan subjek untuk pemecahan secara acak pada posisi basa adenine, sitosin, guanine dan timin menggunakan agen kimia spesifik.
Degradasi senyawa kimia ini didasarkan pada tiga tahap: Perubahan basa nukleotida, penggantian dari basa yang telah mengalami perubahan pada molekul
gulanya dan rantai DNA yang dipecah pada molekul gulanya. Hal ini akan menghasilkan sekumpulan fragmen bertanda radioaktif yang panjangnya
tergantung pada jarak antara letak basa yang dihilangkan dengan ujung molekul bertanda radioaktif. Sekuens DNA dapat dibaca dari hasil pemisahan fragmen
– fragmen yang terbentuk pada gel poliakrilamida Lilian et al. 2002.
b. Metode Sanger
Pada metode Sanger, ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut
primer. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase,
diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida dNTP dan nukleotida pemutus atau dalam konsentrasi rendah ddNTP. Metode ini didasarkan pada
penghambatan sintesis nukleotida akibat adanya persaingan antara dNTP dengan ddNTP. Penempelan ddNTP pada cetakan mengakibatkan berhentinya sintesis
utas yang komplementer dengan DNA cetakan oleh dNTP. Pada rekasi ini dihasilkan berbagai fragmen yang berbeda-beda panjanya dengan label
raadioaktif. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel poliakrilamida Lilian et al. 2002.
c. Filogenetika
Filogenetika menggambarkan klasifikasi secara taksonomi dari suatu organisme berdasarkan pada sejarah evolusi. Proses evolusi melibatkan proses
rekombinan gen dan mutasi genetik pada spesies yang membentuk spesies yang baru. Sejarah evolusi suatu organisme dapat dilihat berdasarkan
perubahan karakter organisme. Karakter merupakan dasar yang digunakan untuk menganalisis hubungan antara spesies Schmidt 2003.
Tujuan dari penyusunan filogenetika salah satunya adalah untuk merekontruksi dengan tepat hubungan antara organisme dan menganalisis
perbedaan yang terjadi dari satu nenek moyang kepada keturunannya. Filogenetika dapat menganalisis perubahan yang terjadi dalam evolusi
organisme yang berbeda. Pohon filogenetik adalah pendekatan logis untuk menunjukkan hubungan evolusi organisme satu dengan yang lainya dapat
digambarkan melalui sebuah poon filogenetik Schmidt 2003. Sebelum menganalisis filogentika suatu organisme, terlebih dahulu mengetahui sejarah
filogeni suatu organisme. Bactrocera sp merupakan genus terbanyak dari jenis lalat buah Diptera:
Tephritidae yang ditemukan di Benua Asia dan Australia dan merupakan salah satu generasi terbesar yaitu 500 spesies Drew 1989; Drew Hancock 2000.
Sebelumnya Bactrocera sp merupakan anggota dari genus Dacus, hal itu disebabkan terjadi kekeliruan identifikasi. Genus Dacus merupakan spesies lalat
buah asli dari Afrika, dan biasanya berasosiasi dengan bunga dari tanaman Cucurbitaecea dan kulit buah tanaman kacang-kacangan Muryati 2007.
Smith et al. 2002 mengatakan Dacus dan Bactrocera merupakan saudara. Hal ini didasarkan pada persamaan radial veins pada sayap yang memenuhi
bagian depan dan sel medial yang sangat lebar. Tergit abdominal enam pada lalat buah betina terpisah dari tergit pertama dan tergit kelima dari lalat buah
betina maupun jantan dilengkapi dengan glandular ceromae. Analisis sekuen DNA mitokondria kedua genus tersebut berkerabat dekat.
Menurut Zhang et al. 2010, yang membedakan 27 spesies Tabel 1 dari delapan subgenera lalat buah berdasarkan gen Cox I dan 16S rRNA yaitu
Afrodacus, Austrodacus, Bactrocera, Daculus, Gymnodacus, Paratridacus, Tetradacus, dan Zeugodacus. Bactrocera dan Zeugodacus merupakan parafiletik,
sedangkan Austrodacus
dan Zeugodacus
yang menyerang
tanaman Cucurbitaeceae tidak berkerabat dengan Afrodacus, Bactrocera, dan
Gymnodacus yang menyerang tanaman sefamili. Paratridacus yang merupakan saudara dari Tetradacus dan tujuh spesies dari Bactrocera termasuk clade
monofiletik, tetapi Daculus mempunyai garis keturunan sendiri yang berbeda dari Bactrocera dan Zeugodacus. Pernyataan tersebut diperjelas pada Gambar 3.
Gambar 3. Kladogram yang menggambarkan hubungan kekerabatan dari 27 spesies Bactrocera sp Zhang et al. 2010.
Zhang et al. 2010 menambahkan bahwa Bactrocera dorsalis complex yang menduduki subgenus Bactrocera merupakan monofiletik. Bactrocera
dorsalis complex mempunyai bentuk dan sifat yang berbeda akan tetapi mereka mempunyai Common ancestor nenek moyang yang sama. Pernyataan tersebut
didukung oleh pernyataan Drew Hancock 1994, Smith et al. 2003, dan Muraji Nakahara 2001 yang menyebutkan bahwa subgenus Bactrocera
merupakan monofiletik.
Tabel 1. Beberapa spesies lalat buah yang diteliti oleh Zhang et al. 2010
NO Spesies
Sub genera
1 Bactrocera carambolae
Bactrocera 2
Bactrocera correcta Bactrocera
3 Bactrocera dorsalis
Bactrocera 4
Bactrocera latifrons, Bactrocera
5 Bactrocera musae,
Bactrocera 6
Bactrocera papayae, Bactrocera
7 Bactrocera philippinensis
Bactrocera 8
Bactrocera zonata , Bactrocera
9 Bactrocera jarvisi
Afrodacus 10
Bactrocera cucumis Austrodacus
11 Bactrocera curvipennis
Bactrocera 12
Bactrocera frauenfeldi Bactrocera
13 Bactrocera kandiensis,
Bactrocera 14
Bactrocera occipitalis Bactrocera
15 Bactrocera psidii
Bactrocera 16
Bactrocera tryoni Bactrocera
17 Bactrocera umbrosa
Bactrocera 18
Bactrocera oleae Daculus
19 Bactrocera calophylli
Gymnodacus 20
Bactrocera expandens Paratridacus
21 Bactrocera minax
Tetradacus 22
Bactrocera tsuneonis Tetradacus
23 Bactrocera caudate
Zeugodacus 24
Bactrocera diaphora , Zeugodacus
25 Bactrocera scutellata
Zeugodacus 26
Bactrocera tau Zeugodacus
27 Bactrocera cucurbitae
Zeugodacus 28
Anastrepha ludens Out group
29 Ceratitis capitata
Out group
Menurut Dharmayanti et al. 2010 sekuen organisme yang mempunyai hubungan dekat atau saudara menempati cabang yang bertetangga pada pohon
filogenetik. Analisis filogenetika juga digunakan untuk mengikuti perubahan yang terjadi secara cepat yang mampu mengubah suatu spesies. Analisis
filogenetika dari keluarga sekuen nukleotida atau asam amino adalah analisis untuk menentukan bagaimana keluarga tersebut diturunkan selama proses
evolusi.
20
BAB III METODE PENELITIAN
A. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di lima lokasi yang berbeda. 1. Pengambilan buah liar dari Famili Cucurbitaceae yang terserang Bactrocera sp
dilakukan di pegunungan Muria Kabupaten Kudus. Pengambilan buah liar dilakukan pada bulan April 2013.
2. Rearing Bactrocera sp dari buah liar dan identifikasi morfologi imago Bactrocera sp dilakukan di Laboratorium Biologi Universitas Negeri Semarang
dan diperkuat di Laboratorium Entomologi UGM pada bulan Mei 2013. 3. Pengambilan sampel B. cucurbitae dan B. papayae dari biakan massal
Laboratorium Entomologi Dasar Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada dilakukan pada bulan April 2014.
4. Analisis molekuler sampel di Laboratorium Virology Fakultas Pertanian Universitas Gajah Mada pada April-Mei 2014.
5. Sekuensing nukleotida ketiga sampel dengan bantuan jasa Lembaga Genetica science dilakukan di Singapura.
B. Subjek Penelitian
Sampel dalam penelitian ini terdiri dari tiga jenis Bactrocera sp. Pertama spesimen Bactrocera sp yang terdiri dari imago dan larva yang berasal dari buah
liar dari Famili Cucurbitaeceae. Sampel pembanding adalah Bactrocera papayae yang menyerang buah salak dan Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah
pare yang diambil dari pembiakan massal lalat buah di Laboratorium Entomologi Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada.
