b. Elektroforesis Gel agarose
Visualisasi DNA dilakukan dengan elektroforesis pada bak elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1,5 gel agarosa. Gel agarosa dibuat dengan
melarutkan agarosa dalam bufer 1X TBE dan dipanaskan sampai tercampur homogen dan larutan menjadi jernih. Larutan agarosa kemudian dituang ke
dalam bak elektroforesis yang sebelumnya telah dipasang sisir cetakan dan ditunggu sampai menjadi keras 15-20 menit. Elektroforesis dilakukan selama
45 menit pada tegangan 50 volt lama waktu running tergantung pada konsentrasi gel dan voltase. Setelah elektroforesis, gel agarosa direndam dalam
larutan Etbr selama 5 detik kemudian direndam dalam aquades selama 15 menit untuk mencuci atau meminimalkan kontaminan Etbr. Setelah itu DNA
divisualisasi menggunakan UV transiluminator. Hasil visualisasi DNA genom dilihat berdasarkan keberadaan pita DNA genom sampel. Hasil isolasi yang baik
dapat dilanjutkan pada metode selanjutnya yaitu amplifikasi PCR.
c. Amplifikasi PCR
Fragmen Cox I yang panjangnya 500 bp diamplifikasi dengan primer forward mtD7 dan primer reverse mtD9. Sekuen primer oligonukleotida dapat
dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Primer Oligonukleotida yang digunakan untuk amplifikasi PCR Nama Primer
Sekuen CO1-F MtD7
5’ATT AGG AGC HCC HGA YAT AGC ATT 3’ CO1-R MtD9
5’GAG GCA AGA TTA AAA TAT AAA CTT CTG 3’
Amplifikasi PCR menggunakan master mix kappa dengan total cocktail 12,5 ul dalam setengah kali reaksi yang dijelaskan pada Tabel 4.
Tabel 4. Cocktail yang digunakan untuk amplifikasi PCR No
Bahan vol x reaksi
1 5x Kappa ekstrak buffer 2,5 ul
2 Mgcl2
0,875 ul 3
ddH20 6,375 ul
4 dNtp
0,375 ul 5
DNA Polimerase 0,125 ul
6 Primer Forward
0,625 ul 7
Primer Revers 0,625 ul
Total 12,5 ul
Tabung PCR yang sudah berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam mesin Termal cycle yang sudah diprogram untuk 35 siklus pada kondisi yang
disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Rangkaian amplifikasi daerah sitokrom oksidase I DNA mitokondria
Tahapan Proses
Suhu Waktu
I Denaturasi
94 3 menit
Denaturasi 94
15 detik II
Annealing 53
15 detik III
Extension 70
1 menit Extention
72 1 menit
Tiga mikroliter sampel dari produk PCR dan dua mikroliter loading dye dirunning pada gel agarosa 1,5 untuk menentukan keberadaan dan ukuran
DNA yang diamplifikasi.
d. Elektroforesis Gel Agarose