Elektroforesis Gel agarose Amplifikasi PCR

b. Elektroforesis Gel agarose

Visualisasi DNA dilakukan dengan elektroforesis pada bak elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1,5 gel agarosa. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan agarosa dalam bufer 1X TBE dan dipanaskan sampai tercampur homogen dan larutan menjadi jernih. Larutan agarosa kemudian dituang ke dalam bak elektroforesis yang sebelumnya telah dipasang sisir cetakan dan ditunggu sampai menjadi keras 15-20 menit. Elektroforesis dilakukan selama 45 menit pada tegangan 50 volt lama waktu running tergantung pada konsentrasi gel dan voltase. Setelah elektroforesis, gel agarosa direndam dalam larutan Etbr selama 5 detik kemudian direndam dalam aquades selama 15 menit untuk mencuci atau meminimalkan kontaminan Etbr. Setelah itu DNA divisualisasi menggunakan UV transiluminator. Hasil visualisasi DNA genom dilihat berdasarkan keberadaan pita DNA genom sampel. Hasil isolasi yang baik dapat dilanjutkan pada metode selanjutnya yaitu amplifikasi PCR.

c. Amplifikasi PCR

Fragmen Cox I yang panjangnya 500 bp diamplifikasi dengan primer forward mtD7 dan primer reverse mtD9. Sekuen primer oligonukleotida dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Primer Oligonukleotida yang digunakan untuk amplifikasi PCR Nama Primer Sekuen CO1-F MtD7 5’ATT AGG AGC HCC HGA YAT AGC ATT 3’ CO1-R MtD9 5’GAG GCA AGA TTA AAA TAT AAA CTT CTG 3’ Amplifikasi PCR menggunakan master mix kappa dengan total cocktail 12,5 ul dalam setengah kali reaksi yang dijelaskan pada Tabel 4. Tabel 4. Cocktail yang digunakan untuk amplifikasi PCR No Bahan vol x reaksi 1 5x Kappa ekstrak buffer 2,5 ul 2 Mgcl2 0,875 ul 3 ddH20 6,375 ul 4 dNtp 0,375 ul 5 DNA Polimerase 0,125 ul 6 Primer Forward 0,625 ul 7 Primer Revers 0,625 ul Total 12,5 ul Tabung PCR yang sudah berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam mesin Termal cycle yang sudah diprogram untuk 35 siklus pada kondisi yang disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Rangkaian amplifikasi daerah sitokrom oksidase I DNA mitokondria Tahapan Proses Suhu Waktu I Denaturasi 94 3 menit Denaturasi 94 15 detik II Annealing 53 15 detik III Extension 70 1 menit Extention 72 1 menit Tiga mikroliter sampel dari produk PCR dan dua mikroliter loading dye dirunning pada gel agarosa 1,5 untuk menentukan keberadaan dan ukuran DNA yang diamplifikasi.

d. Elektroforesis Gel Agarose