Proses pembuatan coated slide
kaca objek adalah sebagai berikut :
1. Kaca objek direndam seluruhnya dalam Aseton selama 10 menit.
2. Masukkan kaca objek dalam larutan APES 3-
aminopropyltriethoxylene, cat no. A3548 sigma 5 mL + aseton 195 mL selama 10 menit.
3. Kaca objek selanjutnya dicuci dengan akuades. 4. Keringkan dalam inkubator bersuhu 37
わC selama satu malam. 5. Kaca objek siap digunakan.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek coated
adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya
ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya, kaca objek diletakkan di atas alat
pemanas hot plate 50-60 わC. Setelah parafin melunak, kaca
objek dikeringkan dan potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.7.2. Prosedur sebelum pulasan antibodi primer
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 µm yang sudah ditempelkan pada kaca objek
silanized .
2. Preparat dimasukkan dalam inkubator 1 malam, suhu 37 わC.
3. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan
xylol sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit.
4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit,
kemudian alkohol 90, 80 dan 70 masing-masing selama 5 menit.
5. Bilas dengan PBS 2 kali masing-masing selama 3 menit. 6. Masukkan ke dalam larutan Buffer Sitrat yang telah
dipanaskan sebelumnya dengan microwave selama 5’ - 2 x masing-masing 5’.
7. Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan. 8. Bilas dengan PBS selama 3 menit 2 kali dan keringkan air di
sekitar potongan jaringan. 9. Tandai di sekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas
dengan Pap Pen.
3.7.3. Protokol Pulasan MMP-9 dengan menggunakan The
Envision+ Dual Link System dari Dako Langkah 1 : Endogenous Enzyme Block
• Bersihkan preparat dari sisa buffer pencuci dengan menggunakan lap khusus.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
• Teteskan Dual endogenous enzyme block
secukupnya untuk menutupi seluruh specimen.
• Inkubasi selama 5 -10 menit. • Bilas dengan air distilasi atau solusi buffer PBS tanpa
mengenai specimen langsung. • Letakkan preparat dalam
bath buffer yang baru.
Langkah 2 : Reagen antibodi primer atau kontrol negatif
• Bersihkan preparat dari sisa cairan buffer pencuci dengan lap khusus.
• Teteskan antibodi primer yang sudah diencerkan
secukupnya menutupi seluruh jaringan. • Inkubasi selama 30 menit.
• Bilas dengan lembut pada solusi buffer dan tempatkan dalam
bath buffer maksimal 1 jam dalam suhu ruangan.
Langkah 3 : Labeled Polymer-HRP
• Bersihkan preparat dari sisa cairan buffer seperti di atas. • Teteskan
labelled polymer secukupnya.
• Inkubasi selama 30 menit. • Bilas dengan lembut pada larutan buffer PBSTris HCl dan
tempatkan dalam bath
buffer selama 5 menit.
Langkah 4 : Substrat-kromogen
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
• Lap kering slide preparatnya seperti biasa. • Teteskan larutan DAB + substrat-kromogen secukupnya
dan inkubasi selama 5-10 menit. • Bilas lembut dengan air distilasi.
Langkah 5 : Counterstain hematoxylin
• Masukkan slide ke dalam cairan Meyer hematoksilin dan inkubasi seperti biasa.
• Bilas dalam bath
air distilasi. • Celupkan slide 10 kali dalam larutan amonia 0,037 molL
atau bluing agent
lainnya. • Bilas slide dalam
bath air distilasi atau deionisasi selama 2-5
menit.
Langkah 6 : Mounting
• Teteskan dengan entelan atau media mounting lain dan tutup dengan kaca penutup.
3.8. Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1. Alat-Alat Penelitian
