BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU Medan, Departemen Patologi Anatomi
RSUP Haji Adam Malik Medan dan Laboratorium swasta di Medan.
3.1.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai dari September 2008 sampai Mei 2009 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data,
pengumpulan sampel, pengolahan data penelitian serta penulisan tesis.
3.2. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan sampel jaringan serviks yang terbagi merata atas tiga kelas yaitu LGSIL, HGSIL dan karsinoma serviks
invasif. Jaringan tersebut kemudian dievaluasi secara imunohistokimia untuk ekspresi MMP-9. Rancangan penelitian ini
akan menggunakan metode observasional dengan pendekatan cross
sectional .
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
Dalam penelitian ini, tidak diberikan perlakuan terhadap variabel, namun hanya dilihat hasil pulasan imunohistokimia MMP-9.
Pengukuran variabelnya hanya dilakukan satu kali dan pada satu saat.
3.3. Kerangka Operasional
IMUNOHISTOKIMIA MMP-9 Karsinoma
invasif HGSIL
LGSIL Pembacaan ulang
Displasia berat
CIN III Displasia
Sedang CIN II
Karsinoma sel skuamous
invasif Displasia
Ringan CIN I
Kriteria eksklusi Blok paraffin
Sediaan serviks
Distribusi Ekspresi MMP-9
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
3.4. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.4.1. Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin yang berasal dari jaringan serviks yang didiagnosa sebagai lesi
prakanker dan karsinoma invasif pada Sentra diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU, RSUP Haji Adam
Malik Medan dan Laboratorium swasta di Medan.
3.4.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan blok parafin dari jaringan serviks yang sesuai dengan kriteria inklusi dan sesuai
besar sampel penelitian.
3.4.3. Besar Sampel Penelitian
Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus uji hipotesis terhadap 2 proporsi :
Z √2PQ + Z √P
1
Q
1
+P
2
Q
2 2
P1-P2
2
n =
Keterangan :
n = besar sampel å n
1
= n
2
= n
3
Z = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya tergantung pada nilai yang ditentukan.
untuk = 0,05
å Z = 1,96
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
Z = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya tergantung pada nilai yang ditentukan.
untuk = 0,20
å Z = 0,842 P
1
= proporsi penderita kanker serviks invasif = 0,83 î menurut salah satu studi, penderita kanker serviks
invasif di negara sedang berkembang = 83,2 kepustakaan no.4
Q
1
= 1- P
1
= 1 – 0,83 = 0,17 P
2
= proporsi penderita lesi prakanker high grade
SIL = 0,15 î menurut studi ALTS
Trial , persentase keseluruhan
CIN2 dan CIN3 dalam populasi = 15 kepustakaan
no.4 Q
2
= 1- P
2
= 1 - 0,15 = 0,85 P =
½ P
1
+P
2
= ½ 0,83 + 0,15 = 0,49 Q = 1- P = 1 – 0,49 = 0,51
Hasil perhitungan : n = [ 1,96
√20,490,51 + 0,842√0,830,17+0,150,85 ]
2
0,50
2
= 1,3857 + 0,4364
2
0,50
2
= 13,28 ≈ 13
Jadi dibutuhkan sampel minimal untuk masing-masing kelompok lesi prakanker dan karsinoma invasif serviks adalah 13.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
Besar keseluruhan sampel minimal yang diikutkan dalam penelitian ini adalah 3 x 13 = 39 sampel.
3.5. Kriteria Inklusi dan Kriteria Eksklusi 3.5.1. Kriteria Inklusi
Yang termasuk kriteria inklusi adalah sediaan blok parafin jaringan serviks dan slide pulasan Hematoksilin-Eosin yang
didiagnosa dengan displasia ringan CIN I, displasia sedang CIN II, displasia berat CIN III dan karsinoma sel skuamous
invasif.
3.5.2. Kriteria Eksklusi
• Sediaan blok parafin jaringan serviks yang bukan didiagnosa sebagai displasia ringan CIN I, displasia sedang CIN II,
displasia berat CIN III dan karsinoma sel skuamous invasif. • Sediaan jaringan serviks yang didiagnosa dengan keganasan
yang lain seperti adenokarsinoma serviks, karsinoma undifferentiated serviks dan tumor sekunder metastase.
• Sediaan blok parafin yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut dengan pulasan imunohistokimia MMP-9.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
3.6. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 3.6.1. Variabel Penelitian
Variabel yang menjadi perhatian di dalam penelitian ini adalah : • Variabel bebas berupa tampilan immunohistokimia MMP-9
• Variabel terikat berupa lesi prakanker dan karsinoma sel skuamous serviks invasif.
3.6.2. Definisi Operasional
• MMP-9 adalah suatu enzim yang mampu mendegradasi berbagai komponen dari ECM Extra Cellular Matrix dalam
proses invasi sel tumor dalam hal ini karsinoma sel skuamous pada serviks serta proses metastasis.
• Hasil pulasan immunohistokimia MMP-9 adalah tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel stroma yang
dinyatakan dengan : ̇ Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat,
dimana pada saat proses yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen
DAB. ̇ Positif, bila terlihat tampilan pulasan warna coklat pada
sitoplasma sel epitel ataupun stroma dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400X pada 5 lokasi
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol + juga menampilkan warna yang sama.
Yang dinilai pada jaringan ada 2 yaitu : î Skor intensitas warna coklat :
0 = negatif +1 = lemah
+2 = sedang +3 = kuat
î Skor kuantitas : banyaknya sel
yang positif terwarnai F = Fokal setempat jumlah sel yang terwarnai 50
D = Diffuse merata jumlah sel yang terwarnai 50
• Yang dimaksud dengan lesi prakanker adalah lesi displasia ringan CIN I, displasia sedang CIN II dan displasia berat
CIN III.
Displasia serviks Cervical Intraepithelial Neoplasm = CIN adalah perubahan neoplastik pada sel epitel pelapis serviks
berupa peningkatan proliferasi, ukuran, konfigurasi serta orientasi sel yang masih terbatas pada epitel.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
̇ Displasia ringan adalah perubahan neoplastik pada sel yang hanya terjadi pada sepertiga bawah dari membran
basalis epitel pelapis skuamous. ̇ Displasia sedang adalah perubahan neoplastik pada sel
yang terjadi pada minimal setengah ketebalan epitel pelapis skuamous mulai dari membran basalis.
̇ Displasia berat adalah perubahan neoplastik pada sel yang meliputi hampir seluruh ketebalan epitel pelapis skuamous
namun membran basalis masih intak. Dalam hal ini, bila terdapat lesi karsinoma insitu, kami kelompokkan bersama
dengan lesi displasia berat.
• Dalam penelitian ini, displasia kami kelompokkan menjadi dua tingkatan menurut sistem Bethesda yaitu LGSIL Low Grade
Squamous Intraepithelial Lesion dan HGSIL High Grade Squamous Intraepithelial Lesion. Dimana menurut sistem ini,
yang tercakup dalam LGSIL adalah displasia ringan CIN I dan yang tercakup dalam HGSIL adalah displasia sedang sampai
berat CIN II dan CIN III bahkan karsinoma in situ. Lesi-lesi prakanker ini sering dijumpai secara bersamaan. Bila ditemukan
beberapa lesi prakanker secara bersamaan, maka diagnosa akan dikelompokkan ke dalam variabel yang lebih berat.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
• Karsinoma sel skuamous invasif adalah tumor ganas pada epitel pelapis skuamous pada serviks yang telah mengadakan infiltrasi
ke stroma sekitarnya dimana bisa dipastikan membrana basalisnya tidak intak lagi. Dalam penelitian ini, karsinoma sel
skuamous invasif tidak kita bedakan berdasarkan tipenya apakah keratinizing membentuk zat mutiara tanduk atau non
keratinizing tidak membentuk zat mutiara tanduk.
3.7. Prosedur dan Teknik Penelitian 3.7.1. Pembuatan sediaan mikroskopis
Sediaan mikroskopis dibuat dengan cara sebagai berikut : 1. Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan dalam
freezer sampai cukup dingin, selanjutnya dipotong tipis dengan
menggunakan mikrotom dengan tebal 4 µm. Setiap blok parafin, dipotong ulang 1 kali untuk pulasan imunohistokimia
MMP-9. 2. Sampel blok parafin yang sudah dipotong tipis 4 µm
ditempelkan pada kaca objek.
Pada pulasan imunohistokimia MMP-9 digunakan kaca objek yang telah di-
coating dengan poly-L-lysine atau
Silanized slide agar jaringan dapat menempel pada kaca objek selama proses
pulasan imunohistokimia.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
Proses pembuatan coated slide
kaca objek adalah sebagai berikut :
1. Kaca objek direndam seluruhnya dalam Aseton selama 10 menit.
2. Masukkan kaca objek dalam larutan APES 3-
aminopropyltriethoxylene, cat no. A3548 sigma 5 mL + aseton 195 mL selama 10 menit.
3. Kaca objek selanjutnya dicuci dengan akuades. 4. Keringkan dalam inkubator bersuhu 37
わC selama satu malam. 5. Kaca objek siap digunakan.
Cara menempelkan potongan tipis pada kaca objek coated
adalah menggunakan ujung pisau atau pinset yang runcing. Potongan tipis dipisahkan dan diratakan dengan memasukkannya
ke dalam air hangat. Setelah mengembang, pindahkan ke atas kaca objek. Selanjutnya, kaca objek diletakkan di atas alat
pemanas hot plate 50-60 わC. Setelah parafin melunak, kaca
objek dikeringkan dan potongan jaringan siap untuk dipulas.
3.7.2. Prosedur sebelum pulasan antibodi primer
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 µm yang sudah ditempelkan pada kaca objek
silanized .
2. Preparat dimasukkan dalam inkubator 1 malam, suhu 37 わC.
3. Deparafinisasi dengan mencelupkan preparat ke dalam cairan
xylol sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit.
4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98 sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit,
kemudian alkohol 90, 80 dan 70 masing-masing selama 5 menit.
5. Bilas dengan PBS 2 kali masing-masing selama 3 menit. 6. Masukkan ke dalam larutan Buffer Sitrat yang telah
dipanaskan sebelumnya dengan microwave selama 5’ - 2 x masing-masing 5’.
7. Dinginkan selama 20 menit dalam suhu ruangan. 8. Bilas dengan PBS selama 3 menit 2 kali dan keringkan air di
sekitar potongan jaringan. 9. Tandai di sekeliling potongan jaringan yang ingin dipulas
dengan Pap Pen.
3.7.3. Protokol Pulasan MMP-9 dengan menggunakan The
Envision+ Dual Link System dari Dako Langkah 1 : Endogenous Enzyme Block
• Bersihkan preparat dari sisa buffer pencuci dengan menggunakan lap khusus.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
• Teteskan Dual endogenous enzyme block
secukupnya untuk menutupi seluruh specimen.
• Inkubasi selama 5 -10 menit. • Bilas dengan air distilasi atau solusi buffer PBS tanpa
mengenai specimen langsung. • Letakkan preparat dalam
bath buffer yang baru.
Langkah 2 : Reagen antibodi primer atau kontrol negatif
• Bersihkan preparat dari sisa cairan buffer pencuci dengan lap khusus.
• Teteskan antibodi primer yang sudah diencerkan
secukupnya menutupi seluruh jaringan. • Inkubasi selama 30 menit.
• Bilas dengan lembut pada solusi buffer dan tempatkan dalam
bath buffer maksimal 1 jam dalam suhu ruangan.
Langkah 3 : Labeled Polymer-HRP
• Bersihkan preparat dari sisa cairan buffer seperti di atas. • Teteskan
labelled polymer secukupnya.
• Inkubasi selama 30 menit. • Bilas dengan lembut pada larutan buffer PBSTris HCl dan
tempatkan dalam bath
buffer selama 5 menit.
Langkah 4 : Substrat-kromogen
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
• Lap kering slide preparatnya seperti biasa. • Teteskan larutan DAB + substrat-kromogen secukupnya
dan inkubasi selama 5-10 menit. • Bilas lembut dengan air distilasi.
Langkah 5 : Counterstain hematoxylin
• Masukkan slide ke dalam cairan Meyer hematoksilin dan inkubasi seperti biasa.
• Bilas dalam bath
air distilasi. • Celupkan slide 10 kali dalam larutan amonia 0,037 molL
atau bluing agent
lainnya. • Bilas slide dalam
bath air distilasi atau deionisasi selama 2-5
menit.
Langkah 6 : Mounting
• Teteskan dengan entelan atau media mounting lain dan tutup dengan kaca penutup.
3.8. Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1. Alat-Alat Penelitian
Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah : mikrotom, waterbath
, hot plate
, freezer
, inkubator, staining jar, rak kaca objek, kaca objek, rak inkubasi, pensil
Diamond , pipet mikro,
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung
sentrifuge ,
microwave ,
thermolyte stirrer , kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.
3.8.2. Bahan Penelitian
• Blok parafin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai lesi serviks displasia ringan,
sedang, berat dan karsinoma sel skuamous invasif. • Pulasan imunohistokimia menggunakan metode
The EnVision+ Dual Link System kit,
teknik pulasan IHK 2 langkah. Antibodi primer yang digunakan adalah Rabbit
Polyclonal Hu- antibody MMP-9 dengan pengenceran 1 : 20.
The EnVision+ Dual Link System kit terdiri dari :
X 1 botol Dual endogenous enzyme block
15 ml X 1 botol
Labelled polymer-HRP
15 ml X 1 botol DAB+ Substrat Buffer
18 ml X 1 botol DAB+ Chromogen
1 ml • Larutan PBS :
X NaCl 87,5 gr + KH
2
PO
4
1,92 gr dalam aquadest 800 ml. X Tambahkan dengan Na
2
HPO
4
2H
2
O 15,33 gr, aduk sampai larut.
X Tambahkan aquades sampai satu liter. X Bila akan digunakan, harus diencerkan 10X.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
• Larutan Buffer Sitrat : X
Citric acid 2,1 gr dilarutkan dalam 1 Liter aquadest.
X Ditetesi dengan NaOH 2 M sampai tercapai pH 6. • Larutan DAB + Substrat-kromogen 1 ml larutan cukup untuk
10 jaringan : X Langkah 1 : Masukkan ke aliquot 1 ml substrat buffer
secukupnya ke dalam kontainer tergantung dari jumlah specimen yang akan dikerjakan.
X Langkah 2 : Untuk setiap 1 ml buffer, tambahkan setetes 20µL cairan DAB+ kromogen, campurkan segera.
X Larutan DAB+ substrat kromogen ini hanya stabil dalam ± lima hari bila disimpan dalam suhu 2-8
わC.
3.9. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunohistokimia MMP-9 terhadap sampel sediaan jaringan serviks.
Untuk penilaian terhadap pulasan imunohistokimia MMP-9 adalah sebagai berikut :
• Kontrol positif : jaringan yang telah diketahui positif terhadap MMP-9 pada penelitian terdahulu dalam hal ini sarkoma, dan
jaringan placenta atau jaringan hepar. • Kontrol negatif : karsinoma serviks dengan antibodi primer
yang digantikan dengan serum normal.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
• Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel epitel maupun stroma.
3.10. Teknik Analisis Data
1. Untuk melihat gambaran karakteristik penderita lesi prakanker dan karsinoma invasif pada serviks, hasil disajikan dalam bentuk
tabulasi dan dideskripsikan tanpa diuji. 2. Untuk mengevaluasi derajat keterlibatan Matrix Metalloproteinase
9 MMP-9 secara imunohistokimia pada lesi prakanker serviks dan kanker serviks invasif, hasil akan disajikan dalam bentuk
tabulasi dan dideskripsikan. 3. Dan untuk melihat sifat hubungan antara level imunoekspresi
MMP-9 dengan prognosis lesi prakanker dan karsinoma serviks invasif, digunakan uji korelasi Spearmen.
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Pemeriksaan imunohistokimia MMP-9 dilakukan terhadap 50 sediaan blok parafin jaringan histopatologi serviks yang sebelumnya
didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin sebagai lesi prakanker LGSIL dan HGSIL serta karsinoma invasif. Perincian
karakteristik dari 50 sampel tersebut adalah sebagai berikut :
Tabel 4.1. Gambaran karakteristik penderita lesi prakanker dan kanker serviks invasif
Karakteristik Parameter
n Pap I
2 4,0
Pap Smear Pap II
29 58,0
Pap III 14
28,0 Pap IV
5 10,0
Jumlah 50
100,0 Specimen LEEP
10 20,0
Biopsi 32 64,0
TAH 8
16,0 Jumlah
50 100,0
LGSIL 12 24,0
Histopatologi LGSIL + radang
4 8,0
HGSIL 11 22,0
HGSIL + radang 6
12,0 Ca
Invasif 11
22,0
Jessy Chrestella : Gambaran Imunoekspresi Matrix Metalloproteinase 9 Mmp-9 Pada Lesi-Lesi Prakanker Dan Karsinoma Serviks Invasif, 2009
Kategori