Interesterifikasi Enzimatik TINJAUAN PUSTAKA

11 Triasilgliserol khas komponen CBE dapat disintesis melalui interesterifikasi enzimatik. Standard lemak cokelat menurut SNI disajikan pada Tabel 3. Tabel 2 . Jenis-jenis dan sifat CBA Cocoa Butter Alternative CBS CBR CBE • Merupakan lemak nabati laurat • Memiliki kandungan asam lemak laurat tinggi 40 - 50 • Memiliki titik leleh yang rendah • Memiliki sifat kimia yang berbeda dengan CB • Memiliki kesamaan sifat fisik dengan CB Idris dan Dian, 2005 • Kristalisasi cepat, sehingga tidak memerlukan proses tempering • Memiliki profil pelelehan yang tajam dan memberikan sensasi dingin pada pelelehan • Merupakan lemak nabati non laurat • Memiliki distribusi asam lemak serupa dengan CB • Memiliki komposisi TAG berbeda dengan CB • Mengkristal spontan ke bentuk stabilnya yaitu β’ polymorph sehingga tidak memerlukan proses tempering • Tidak menimbulkan kesan berlemak waxy sensation Karlshamns, 2002 • Tahan pada cuaca dingin atau cukup panas Wainwright, 1999 • Merupakan lemak nabati non laurat • Memiliki sifat fisik serupa dengan CB, misalnya profil pelelehan Idris dan Dian, 2005 • Memiliki komposisi TAG serupa dengan CB Idris dan Dian, 2005 • Dapat dicampur dengan CB dalam berbagai porsi tanpa mengubah karakteristik fisik produk akhir Idris dan Dian, 2005 • Masih memerlukan proses tempering • Tidak mengandung lemak trans Sumber: Hernandez et al. 2005

D. Interesterifikasi Enzimatik

Terdapat empat proses modifikasi untuk mengubah karakteristik fisikokimia minyak lemak yaitu hidrogenasi, fraksinasi, blending, dan interesterifikasi Idris dan Dian, 2005. Proses-proses modifikasi lemak bertujuan mengubah karakteristik kimia sehingga dapat diperoleh sifat fisik yang diinginkan. Hidrogenasi telah banyak dilakukan sebelumnya dengan tujuan meningkatkan stabilitas edible oil karena mengubah asam lemak polyunsaturated menjadi asam lemak monounsaturated dan asam lemak 12 jenuh. Hidrogenasi adalah proses penambahan atom hidrogen pada minyak untuk mengeraskannya sehingga dapat memberikan umur simpan yang panjang Murano, 2003. Tabel 3. Standard lemak cokelat Kriteria satuan Persyaratan Keadaan bau, rasa, dan warna - normal, khas lemak kakao Indeks bias - 1.456-1.459 Titik leleh awal dan akhir °C awal=30-34; akhir =31-35 Asam lemak bebas sebagai asam oleat maks 1.75 Bilangan penyabunan mgKOHg asam lemak 181-198 Bilangan iod Wijs g100 g 33-42 Bahan tak tersabunkan maks 0.35 Cemaran logam Pb, Cu, Fe - maks 0.5, maks 0.4, maks 2.0 Arsen - maks 0.5 Sumber: SNI 1995 Proses hidrogenasi parsial dapat menghasilkan asam lemak trans. Keberadaan asam lemak trans menjadi suatu kekhawatiran karena dapat meningkatkan kadar LDL darah kolesterol dan juga dapat menurunkan kadar HDL pada darah. Hal inilah yang membuat masyarakat kurang menyukai produk hidrogenasi Akoh dan Moussata, 1998. Koran kesehatan yang dikeluarkan oleh USDA untuk para orang tua Anonim, 2009 juga menyarankan untuk menggunakan vegetable oil dengan tanpa kandungan lemak trans. Selain hidrogenasi terdapat proses fraksinasi. Fraksinasi merupakan proses yang dapat membagi minyak menjadi dua bagian yaitu komponen yang memiliki titik leleh lebih tinggi dan komponen dengan titik leleh yang lebih rendah Murano, 2003. Menurut Arghainc 2008 fraksinasi dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu fraksinasi kering, fraksinasi basah, dan fraksinasi dengan pelarut. Fraksinasi kering merupakan istilah untuk proses fraksinasi yang dilakukan dengan modifikasi suhu. Prinsip proses ini adalah pendinginan secara bertahap, sehingga fraksi dengan titik cair lebih tinggi akan membentuk 13 kristal terlebih dulu dibandingkan dengan fraksi yang memiliki titik cair lebih rendah. Fraksi-fraksi yang terbentuk dipisahkan dengan proses penyaringan. Proses fraksinasi kering lebih disukai dibanding fraksinasi lainnya karena lebih ramah lingkungan. Proses fraksinasi basah menggunakan surfaktan atau larutan deterjen untuk membasahi kristal pada fraksi stearin Arghainc, 2008. Pelarut yang biasa digunakan pada proses fraksinasi dengan pelarut antara lain heksana, aseton, isopropanol, atau n-nitropropana. Proses pemisahan berbagai TAG menjadi satu atau lebih fraksi ini dilakukan dengan menggunakan perbedaan kelarutan TAG yang tergantung pada berat molekul dan derajat ketidakjenuhan Murano, 2003. SCI 2000 menyebutkan beberapa kelemahan fraksinasi dalam produksi lemak antara lain prosesnya yang relatif mahal di industri minyak. Oleh karena fraksinasi selalu menghasilkan paling sedikit dua fraksi produk, sehingga dalam prosesnya dibutuhkan optimasi untuk salah satu fraksi yang diinginkan. Contoh aplikasi fraksinasi adalah pada produksi minyak goreng dan lemak plastis untuk shortening yang keduanya berasal dari material awal yang sama Murano, 2003. Proses modifikasi lemak lainnya yaitu blending yang merupakan pencampuran antara dua lemak dimana sifat lemak yang satu melengkapi sifat lemak yang lainnya sehingga dapat menghasilkan produk sesuai harapan. Untuk memproduksi CBE dapat dilakukan blending antara lemak nabati kaya TAG POP dengan exotic fats yang kaya POS dan SOS. Contoh exotic fat antara lain lemak illipe, lemak sal, shea butter, dan kokum butter Lipp dan Anklam, 2001. Ketersediaan exotic fats di alam semakin terbatas sehingga menjadikan interesterifikasi sebagai pilihan yang baik bagi proses modifikasi lemak untuk sintesis komponen CBE. Selain itu Akoh dan Moussata 1998 menyebutkan bahwa campuran hasil physical blends memiliki kestabilan oksidatif lebih rendah dari pada campuran hasil interesterifikasi. Interesterifikasi juga dilihat sebagai alternatif pengganti proses hidrogenasi parsial edible oils and fats Sundram dan Basiron, 2009. 14 Interesterifikasi adalah proses penyusunan kembali atau kombinasi ulang asam lemak di dalam dan di antara molekul-molekul TAG Murano, 2003. Interesterifikasi dapat membuat perubahan penting dalam fungsionalitas lemak. Interesterifikasi pertama kali digunakan untuk memperbaiki sifat creamy dan berpasir grainy pada lard, yang asam palmitatnya terletak dominan pada posisi sn-2 TAG, pada tahun 1940-an di United States. Proses ini dapat mengeliminasi tekstur berpasir lard dan menghasilkan kristal beta prime yang diinginkan Idris dan Dian, 2005. Lida et al. 2002 menyatakan bahwa proses interesterifikasi tidak menyebabkan isomerisasi ikatan rangkap pada asam lemak, sehingga tidak mengubah komposisi asam lemak tetapi mengubah profil lemakminyak. Bobot molekul, ketidakjenuhan, dan distribusi posisi asam lemak pada kerangka TAG merupakan faktor penting yang menentukan sifat fisik lemakminyak Wilis dan Marangoni, 2002. Distribusi asam lemak pada kerangka gliserol mengubah susunan TAG awal yang berpengaruh pada karakteristik fisik minyaklemak meliputi pelelehan dan kristalisasi Idris dan Dian, 2005. Berdasarkan poses pergantian asam lemak itu sendiri, interesterifikasi dapat dibagi menjadi tiga kelompok yaitu transesterifikasi, alkoholisis, dan asidolisis Marangoni dan Narine, 2002. 1. Transesterifikasi Transesterifikasi adalah pertukaran atau penyusunan kembali gugus asil di antara dua ester atau dua TAG sehingga menghasilkan TAG baru dengan komposisi asam lemak yang diinginkan Willis dan Marangoni, 2002. Reaksi ini melibatkan pertukaran asam lemak radikal dari satu ester ke ester lainnya. Reaksi transesterifikasi dapat dilihat pada Gambar 6. Distribusi posisi asam lemak dalam TAG yang dihasilkan dapat mengubah sifat fisik lemak, minyak, atau campurannya. Proses ini juga dapat digunakan untuk memperbaiki sifat tekstural campuran tallows dan rapeseed oil dalam pengembangan CBE Willis dan Marangoni, 2002. 15 Gambar 6 . Reaksi Transesterifikasi 2. Alkoholisis Alkoholisis merupakan reaksi esterifikasi antara alkohol dengan ester lemak untuk menghasilkan ester baru. Selama alkoholisis terjadi hidrolisis TAG sehingga menghasilkan diasilgliserol DAG dan monoasilgliserol MAG yang digunakan sebagai surface active agent dan emulsifier Willis dan Marangoni, 2002. Reaksi alkoholisis dapat dilihat pada Gambar 7. Kegunaan utama alkoholisis adalah dalam reaksi gliserolisis Willis dan Marangoni, 2002. Gliserolisis merupakan pertukaran gugus asil antara gliserol dan TAG untuk memproduksi MAG dan DAG Yang et al., 2003. Pada umumnya reaksi alkoholisis menghasilkan TAG parsial, sehingga kurang baik digunakan untuk mensisntesis atau memodifikasi TAG satu menjadi TAG baru yang diinginkan. Gambar 7. Reaksi Alkoholisis 3. Asidolisis Transfer gugus asil antara asam lemak dengan ester TAG disebut asidolisis. Proses ini termasuk cara efektif penggabungan asam lemak bebas ke dalam kerangka TAG, sehingga menghasilkan TAG baru dengan O O—C—R1 O O—C—R1 O O—C—R1 + + O O—C—R2 O O—C—R2 O O—C—R2 Katalis Lipase Spesifik-1,3 O O O O O—C—R1 O O—C—R2 O O—C—R1 O O—C—R2 O O—C—R1 O O—C—R2 Trigliserida Metanol Asam Lemak Metil Ester Gliserol komposisi ber dilihat pada G Penelitian sebagai katalis 2000, Chandl dan Ozcelik 2005 Chopra et al memperoleh le lipid . Yang merupakan rea Hal ini dilakuka lemak. Willis dan untuk mengga dan DHA den gizinya. Keunt kardiovaskular fungsi sistem oleh Willis da dengan lemak dalam butter ta Reaksi interes logam alkali sepe etoksilat Husum berbeda atau seperti yang diinginkan. Reaksi Gambar 8. Gambar 8. Reaksi Asidolisis an mengenai reaksi asidolisis yang mengg alis telah dilakukan oleh beberapa peneliti anta ndler 2001, Torres et al. 2002, Kim et al. 2004, 2002 k 2005, Cossignani et al. 2005, Subroto et al . 2009. Pada umumnya penelitian ters h lemak dengan sifat berbeda yang dikenal de et al. 2003 juga menyebutkan bahwa r reaksi yang biasa digunakan untuk produksi kukan untuk meningkatkan sifat fungsional d dan Marangoni 2002 juga sudah mengguna nggabungkan asam lemak bebas atau bentuk etil dengan minyak nabati dan hewani untuk me euntungan proses ini antara lain meng kular jantung koroner dan aterosklerosis sert m saraf dan visual yang baik. Asidolisis juga dan Marangoni 2002 untuk menggabungk ak susu sehingga meningkatkan kadar asam lem tanpa kehilangan karakteristik flavor butter. resterifikasi dapat dilakukan secara kimia mengg eperti sodium metoksida Idris dan Dian, 2005 um et al., 2009. Cara ini telah banyak di 16 ksi asidolisis dapat nggunakan lipase ntara lain Xu et al. . 2004, 2002, Can et al . 2008, dan tersebut bertujuan dengan structured reaksi asidolisis oduksi structured lipid. l dan nutrisi suatu unakan asidolisis etil ester dari EPA memperbaiki nilai engurangi resiko erta memperbaiki uga telah dilakukan bungkan asam oleat lemak tidak jenuh nggunakan katalis 2005 atau sodium k dilakukan untuk 17 pembuatan shortening, margarin, dan spreads untuk meningkatkan sifat tekstural, modifikasi sifat pelelehan, dan meningkatkan stabilitas oksidatif Willis dan Marangoni, 2002. Reaksi interesterifikasi kimia bersifat acak dan menghasilkan banyak produk samping, sehingga produk akhir kurang sesuai harapan. Selain itu diperlukan suhu reaksi yang tinggi dan menghasilkan banyak limbah Willis dan Marangoni, 2002. Gupta et al. 2003 yang dirujuk dalam Rajendran et al. 2009 menyatakan bahwa modifikasi minyaklemak secara kimia membutuhkan energi yang tinggi dan tidak spesifik. Setelah interesterifikasi kimia masih diperlukan perlakuan tambahan antara lain pencucian, pemutihan, dan deodorisasi untuk memisahkan produk samping. Selain itu dilakukan purifikasi untuk mendapatkan kualitas produk yang diinginkan Husum et al., 2009 . Selain secara kimia reaksi interesterifikasi dapat dilakukan secara enzimatik. Berbeda dengan interesterifikasi kimia, reaksi interesterifikasi enzimatik bersifat lebih spesifik sehingga menghasilkan rendemen produk akhir yang baik serta sedikit akan produk samping dan limbah. Lipase juga memberikan derajat spesifisitas dan selektivitas yang tinggi untuk interesterifikasi yang dapat menghasilkan beberapa asilgliserol yang diinginkan. Lipase memiliki sifat sedemikian rupa sehingga dapat memutuskan asam lemak yang ada dalam TAG kemudian menyambungnya kembali dengan asam lemak lainnya yang ditambahkan Svendsen, 1994. Kondisi reaksi untuk interesterifikasi enzimatik tidak memerlukan suhu tinggi seperti pada interesterifikasi kimia Willis dan Marangoni, 2002. Proses interesterifikasi enzimatik juga ramah lingkungan karena tidak menggunakan bahan kimiapelarut dan tidak menghasilkan asam lemak trans. Oleh karena itu menurut Macrae 1989 dirujuk dalam Akoh Moussata 1998, reaksi interesterifikasi yang dikatalisis oleh enzim lipase menghasilkan produk dengan kualitas lebih baik dibandingkan dengan produk melalui interesterifikasi kimia. Beberapa lipase digunakan Budijanto et al. 2008, salah satunya berasal dari Candida antartica, dalam reaksi asidolisis untuk memproduksi minyak 18 kaya asam lemak omega-3. Liu et al. 1997 juga telah melakukan interesterifikasi yang dikatalisis lipase untuk sintesis CBE. E. Lipase Produksi lemak dengan sifat fisik dan kimia yang diinginkan seperti pada CBE melalui interesterifikasi enzimatik, telah menjadi area popular di penelitian bioteknologi Mojovic et al., 1993. Pada reaksi asidolisis ini digunakan enzim lipase sebagai katalis reaksi. Penggunaan katalis bertujuan untuk mengefisiensikan reaksi yaitu menurunkan suhu reaksi dan mempersingkat waktu reaksi Nawar, 1996. Ditinjau dari segi energi aktivasi reaksi Ea, reaksi dengan bantuan enzim membutuhkan energi yang lebih rendah dibandingkan dengan reaksi asalnya seperti yang dilaporkan oleh Raharja dan Gunadi 2000. Energi aktivasi adalah jumlah energi yang dibutuhkan untuk mengkonversi molekul substrat dari energi awal menjadi kompleks ES enzim-substrat Murano, 2003. Kompleks ini selanjutnya diubah kembali menjadi enzim dan pembentukan produk. Pengaruh enzim sebagai katalis pada energi aktivasi disajikan pada Gambar 9. Gambar 9. Penurunan energi aktivasi karena adanya enzim sebagai katalis Enzim merupakan biokatalis dengan efektivitas yang tinggi dan bersifat spesifik Hidayat et al., 2009. Lipase triasilgliserol asilhidrolase, EC 3.1.1.3 adalah enzim yang mengkatalisis hidrolisis ikatan karboksilat ester secara reversibel di bawah kondisi alami. Akan tetapi Sharma et al. 2001 dirujuk T T Arah Reaksi Perubahan Energi K e b u tu h a n e n e rg i ta n p a k a ta lis K e b u tu h a n E n e rg i d e n g a n k a ta lis 19 dalam Rajendran et al. 2009 menyebutkan bahwa lipase juga dapat mengkatalisis síntesis bentuk ester dari gliserol dan asam lemak. Lipase secara luas terdapat dalam hewan, tumbuhan, dan mikroba Mojovic et al., 1993. Kondisi air berlebih akan mengarahkan ke reaksi hidrolisis TAG dengan solubilitas rendah dalam air. Akan tetapi dalam kondisi air yang terbatas, cenderung ke arah reaksi kebalikannya yaitu síntesis ester atau pembentukan gliserida dari asam lemak dan gliserol Sharma et al. 2001 dirujuk dalam Rajendran et al. 2009. Lipase juga berperan secara luas dalam reaksi biokonversi lainnya seperti hidrolisis, interesterifikasi, esterifikasi, alkoholisis, asidolisis, dan aminolisis Pandey et al. 1999 dirujuk dalam Rajendran et al. 2009. Jaeger et al. 1998 dirujuk dalam Rajendran et al. 2009 menyebutkan bahwa keunikan lipase terletak pada aktivitasnya yang sangat baik terhadap substrat tak larut air dan aktivitas lipase meningkat pada substrat interfase minyak-air. Struktur tiga dimensi dapat menjelaskan tentang aktivasi interfasial. Aktivasi lipase yang terjadi pada interfase diduga disebabkan oleh perubahan konformasi enzim dengan membukanya selubung heliks protein yang menutupi sisi aktif enzim Iwai dan Tsujisaka, 1984. Seperti yang disebutkan Jaeger et al. 1999 bahwa sisi aktif lipase yang ditutupi oleh lingkaran permukaan yang disebut lid atau flap terbuka sehingga sisi aktif enzim dapat diakses substrat. Aktivitas optimum lipase diperoleh dalam sistem seperti emulsi, dimana area permukaan substrat tinggi. Lipase tidak hanya aktif pada fase normal emulsi dimana substrat diemulsifikasi dalam sistem aqueous minyak dalam air. Lipase juga aktif dan bahkan sering lebih aktif pada kondisi kebalikannya air dalam minyak. Selain itu keaktifan lipase juga didapat dalam sistem misel reverse yang mengandung pelarut organik dari substrat. Kegunaan lipase yang luas, yaitu dapat bereaksi pada daerah substrat yang luas menyebabkan lipase dapat mengkatalisis reaksi transesterifikasi dan sintesis ester stereospesifik Mojovic et al ., 1993. Kemampuan lipase tersebut menjadikannya sebagai pilihan aplikasi yang potensial dalam berbagai industri termasuk industri pangan. 20 Berdasarkan spesifisitasnya terhadap substrat, lipase dapat dibagi menjadi empat yaitu lipase dengan spesifisitas asam lemak, spesifisitas alkohol, spesifisitas jenis lipid, dan spesifisitas posisionalregiospesifik Hariyadi, 1995. Spesifisitas regiospesifik dan asam lemak dari lipase mikrobial telah dikembangkan untuk dimanfaatkan dalam reaksi esterifikasi dan transesterifikasi Gupta et al. 2003 dirujuk dalam Rajendran et al. 2009. Lipase dengan spesifisitas posisional dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu lipase non spesifik dan lipase spesifik 1,3 atau 2. Lipase non spesifik bekerja pada asam-asam lemak dari ketiga posisi ikatan. Lipase spesifik 1,3 atau 2 hanya dapat mengkatalisis TAG pada ikatan sn-1,3 atau sn-2. Jenis lipase yang digunakan pada penelitian ini adalah lipase spesifik-1,3. Menurut Roy dan Bhattacharyya 1993 produk reaksi lemak yang dikatalisis lipase spesifik-1,3 dapat dibedakan dari produk reaksi secara kimia dari asam lemak pada posisi sn-2. Tidak seperti interesterifikasi kimia yang bersifat acak, interesterifikasi enzimatik dapat mempertahankan asam lemak posisi sn-2 pada kerangka TAG produk hasil reaksi. Umumnya jenis asam lemak posisi sn- 2 pada minyak nabati adalah asam lemak tidak jenuh, yaitu oleat. Berdasarkan Sundram dan Basiron 2009, asam oleat diketahui berperan dalam penurunan kadar kolesterol darah. Hal ini berimplikasi pada keuntungan nilai gizi yang dapat diperoleh Zhang et al. 2001, karena diketahui bahwa posisi asam lemak jenuh misal C:16 pada sn-2 dapat bersifat aterogenik. Pengaruh penggunaan lipase spesifik-1,3 dan lipase non spesifik pada interesterifikasi enzimatik juga dilakukan Lai et al. 1998 pada campuran palm stearin dan minyak bunga matahari. Hasil pada campuran interesterifikasi yang menggunakan lipase spesifik-1,3 tersebut memiliki SMP yang lebih rendah dari kontrol dibandingkan campuran yang menggunakan lipase non spesifik. Terdapat berbagai macam lipase komersial yang telah banyak digunakan untuk berbagai tujuan antara lain Novozym-435 berasal dari Candida antartica , Lipozyme-IM berasal dari Rhizomucor miehei Suhendra et al., 2008, lipase R. arrhizus, lipase Mucor circinelloides, dan lipase 21 Pseudomonas sp. Jie et al. 2002 menyebutkan bahwa dari beberapa lipase yang ditelitinya, Novozyme-435 merupakan enzim yang efisien untuk interesterifikasi karena menunjukkan ketahanannya terhadap hidrolisis gliserida dan menghasilkan DAG yang paling rendah. Lipase spesifik-1,3 yang digunakan adalah Novozym 435, berasal dari bakteri Candidia antartica. Lipase C. antartica diketahui sudah tersedia secara komersial. Lipase C. antartica juga telah terbukti dapat menginkorporasikan asam lemak omega-3 ke molekul TAG Budijanto et al. 2008. Hasil pengujian stabilitas enzim yang dilakukan Budijanto et al. 2008 juga menunjukkan bahwa umur pakai enzim lipase C. antartica pada suhu 40, 50, dan 60 o C, masing-masing adalah 6000, 4899, dan 4773 menit. Garcia et al. 1999 melaporkan bahwa lipase amobil C. antartica menunjukkan aktivitas terbaik di antara enam lipase komersial untuk reaksi asidolisis antara asam linoleat terkonjugasi dengan butterfat. Novozym 435 merupakan enzim amobil, yaitu enzim yang aktivitas katalitiknya dapat digunakan secara berulang atau terus menerus Chibata, 1978. Berbagai metode amobilisasi lipase telah dikembangkan Hidayat et al., 2009. Rahmawati 2000 juga telah melakukan amobilisasi lipase untuk memproduksi CBE. Terdapat beberapa alasan penggunaan lipase amobil, antara lain lipase amobil lebih stabil dibandingkan dengan enzim bebas dan mudah dipisahkan dari campuran sehingga dapat digunakan kembali Hidayat et al. , 2009. Amobilisasi dapat meningkatkan termostabilitas lipase, kekuatan mekanikal, karakter hidrofobikhidrofilik, regenerasi, dan fungsionalitas lain enzim Van et al. 1998, dirujuk dalam Zhang et al. 2001. Hal ini menyebabkan interesterifikasi enzimatik dapat bersaing dengan interesterifikasi kimia konvensional yang bersifat acak Zhang et al., 2001. Menurut Willis dan Marangoni 2002 terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas lipase selama interesterifikasi antara lain pH, kadar air, temperatur, komposisi substrat, komposisi produk, dan kandungan lipase. Kisaran pH optimum kebanyakan lipase adalah 7 sampai dengan 9 walaupun beberapa lipase dapat aktif pada nilai pH yang lebih lebar, yaitu sekitar pH 4 sampai dengan 10. Kondisi reaksi interesterifikasi dengan pH yang jauh dari 22 optimum dapat menyebabkan percepatan inaktivasi enzim Willis dan Marangoni, 2002. Umumnya peningkatan temperatur meningkatkan laju interesterifikasi, akan tetapi temperatur yang sangat tinggi dapat mengurangi laju reaksi karena terjadi denaturasi irreversibel enzim. Macrae 2000 mereaksikan lipase pada suhu 70˚C untuk proses interesterifikasi enzimatik. Subroto et al. 2008 juga melaporkan bahwa pada suhu 70°C inkorporasi asam lemak terlihat tinggi. Selain itu, diperlukan suhu 70°C untuk melelehkan asam stearat sehingga dapat bercampur sempurna dengan RBDPO sebelum ditambahkan lipase. Lipase yang berasal dari hewan dan tumbuhan biasanya kurang tahan panas dibandingkan dengan lipase mikroba ekstraselular. Malacata et al. 1992 dirujuk dalam Subroto et al. 2008 menyebutkan bahwa lipase amobil secara umum tahan terhadap pengaruh suhu. Pada sistem tanpa pelarut, temperatur harus cukup tinggi untuk menjaga substrat berada dalam fase liquid. Berbeda halnya jika menggunakan pelarut organik, karena mereka mudah melarutkan substrat hidrofobik. Bagaimanapun, untuk aplikasi industri pangan dimana pelarut organik dihindari, temperatur reaksi biasanya lebih tinggi. Akan tetapi temperatur yang sangat tinggi dapat mengurangi waktu paruh lipase walaupun amobilisasi dapat meningkatkan stabilitas lipase di bawah kondisi temperatur tinggi Willis dan Marangoni, 2002. Lipase amobil adalah lebih stabil untuk deaktivasi termal karena amobilisasi membatasi perpindahan dan dapat mengurangi derajat pembukaan dan denaturasi Willis dan Marangoni, 2002. Kadar air dalam sebuah sistem reaksi merupakan faktor yang menentukan apakah kesetimbangan reaksi ke arah hidrolisis atau sintesis ester. Sintesis ester tergantung pada kadar air yang rendah. Kadar air yang terlalu rendah akan mencegah semua reaksi karena lipase membutuhkan sejumlah air tertentu untuk berlangsungnya aktivitas enzim. Terlalu banyak air dapat mencegah interesterifikasi. Hal ini dapat disebabkan penurunan akses substrat hidrofobik ke enzim amobil. Keseimbangan reaksi dapat diusahakan ke arah síntesis ester dengan memindahkan air yang diproduksi selama reaksi dengan penggunaan bejana reaksi berisi larutan garam jenuh. Selain itu dapat digunakan pipa 23 silikon berisi larutan garam, penambahan molekular penyaring di dekat akhir waktu reaksi, dan reaksi berada di bawah kondisi vakum Willis dan Marangoni, 2002. Kadar air optimal untuk interesterifikasi berada pada kisaran 0.04 sampai dengan 11 bv, walaupun kebanyakan reaksi membutuhkan kadar air kurang dari 1 untuk interesterifikasi efektif Willis dan Marangoni, 2002. Aktivitas lipase dapat hilang karena terdapatnya konsentrasi asam lemak bebas yang tinggi. Asam lemak bebas dapat memproduksi gugus asam karboksilat bebas atau terionisasi. Hal ini membuat pH fase mikroakueous di sekitar lipase rendah sehingga terjadi desorpsi air dari interfase. Akan tetapi Willis dan Marangoni 2002 menemukan bahwa asam lemak bebas rantai panjang, misalnya C13:0 dan C17:0, yang digunakan selama reaksi asidolisis memiliki efek yang kurang menghambat reaksi. 24

III. METODOLOGI PENELITIAN