Metode Assay: a. Pewarnaan pada imunohistokimia IHC:
2.3.5. Metode Assay: 2.3.5.a. Pewarnaan pada imunohistokimia IHC:
Analisis imunohistokimia rutin dilakukan melalui sisntesa peptida yang sesuai dengan peptida 16-residu EVFMQLIYDSSLCDLF pada urutan protein terminal C
mammaglobin yang berkonjugasi pada karierCarrier yang kemudian disuntikkan ke kelinci untuk menghasilkan antibodi antimammaglobin pada kelinci poliklonal.
Reagen ini digunakan dalam survei besar tumor payudara primer dari berbagai kelas dan jenis histologi. Kekhususan dari antibodi yang dihasilkan dikonfirmasi dengan
analisis Western blot dari beberapa cell-line tumor payudara manusia dan kanker payudara primer manusia yang diperiksa sebelumnya untuk ekspresi mRNA
mammaglobinWatson et al, 1999 dan Gillanders, 2005. Pola pewarnaan mammaglobin dominan tersebar dalam sel tumor dan
sitoplasma, meskipun beberapa sel menunjukkan pewarnaan lokal yang intens berdekatan dengan nukleus. Dalam jaringan payudara nonneoplastik, sel-sel epitel
positif terlihat jarang dan tersebar dalam lobulus asinus tipe I dan tipe II dan dalam sel-sel kolumnar dari duktus terminal Watson et al, 1999 dan Gillanders, 2005.
2.3.5.b. RT-PCR:
Cerveira et al. pada tahun 2004 mengevaluasi sensitivitas teknik RT-PCR standar sintesis cDNA oleh primer acak diikuti amplifikasi dengan nested-PCR tunggal
Universitas Sumatera Utara
dengan pendekatan yang lebih lugas: satu langkah RT-PCRSintesis cDNA dengan
primer spesifik MGB –I dan PCR tunggal dalam reaksi yang sama, diikuti oleh nested-
PCR dengan primer MG3 dan MG4 dalam tabung reaksi dingin yang sama sepanjang waktu untuk mencegah amplifikasi non-spesifik. Semua kasus yang dipelajari dalam
rangkap dua, dengan analisa simultan dari kontrol negatif donor darah, kontrol positif jaringan payudara dan kontrol air. Primer untuk nested-PCR dan PCR tunggal
berasal dari sekwens dengan nomor akses Genbank U3314710 dan dirancang membatasi rentang ekson-ekson untuk mencegah amplifikasi DNA genomik.
Untuk memeriksa integritas setiap sampel mRNA dan cDNA, dilakukan amplifikasi gen kontrol beta-2-mikroglobulin B2M; Genbank nomor akses NM004048 satu
putaran tunggal PCR dengan kondisi yang identik untuk primer spesifik MGB-I Cerveira et al., 2004.
Kemampuan deteksi metastase tersembunyi oleh RT-PCR sangat sensitif, yakni mampu mendeteksi sedikitnya satu salinan RNA untuk dikopi menjadi gen yang
diekspresikan sampai 1.000 kopi sel. Penggunaan kuantitatif real-time-PCR berdasarkan ambang batas pada sampel klinis, mengakibatkan ekspresi signifikan
tingkat klinis RNA sehingga hasil positif palsu menjadi minimal Backus et al., 2005. Kuantitasi h-MAM mRNA berhasil dicapai dengan realtime RT-PCR kuantitatif,
berdasarkan aktivitas 5-nuklease polimerase TAQ-DNA. Teknik ini memungkinkan
Universitas Sumatera Utara
kuantitasi otomatis dari amplifikasi produk.. Nilai m-RNA yang diukur, dibandingkan dengan nilai dari h-MAM yang mengekspresikan kurva standar cDNA yang diperoleh
dari cell-line EFM-192 yang spefifik terhadap adenokarsinoma payudara Zehentner et al., 2004 and Backus et al., 2005 .
TaqMan probe dirancang untuk annealing regio internal dari produk PCR, dan mereka mengandung pewarna reporter berpendar yang letaknya berdekatan
dengan pewarna quencher. Ketika probe TaqMan berpendar pada panjang gelombang yang tepat, pewarna reporter teraktivasi, sehingga, fluoresensi ini
ditangkap oleh quencher sepanjang probe utuh. Quenching ini disebabkan energi resonansi transfer fluoresensi FRET, di mana energi fluoresensi dari fluorophore
ditransfer ke quencher. Namun, ketika polimerase TAQ-DNA dengan aktivitas 5exonuklease yang menyentuh probe, pewarna reporter dilepaskan dari quencher
dan dapat mulai berpendar. Deteksi akumulasi produk PCR dipantau oleh peningkatan fluoresensi. Yang penting, pembelahan probe hanya terjadi jika probe
dihibridisasi pada target, yang memungkinkan amplifikasi hanya terjadi bila ada yang
terdeteksi Sjödin, 2005.
Gambar 5, Mesin PCR
Universitas Sumatera Utara
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN