mL lalu ditambahkan EL buffer 900 mikroliter, kemudian dibolak-balin secara perlahan. Tabung tersebut diinkubasi selama sepuluh menit di
dalam kulkas dan selanjutnya disentrifus dalam 13000 rpm selama tiga menit. Supernatan dibuang secara hati-hati dan pelan-pelan agar
endapannya tidak ikut terbuang. Hal ini diulangi sampai lima kali, sampai warna supernatan jernih dan endapan sudah berwarna putih. Setelah
diperoleh endapan putih atau cairan sudah jernih, supernatan dibuang dan endapan divortex selama dua puluh detik. Selanjutnya, 300 uL nuclei lysis
solution ditambahkan dan tabung dibolak-balik agar tercampur. Kemudian protein precipitation 100uL ditambahkan dan divortex selama dua puluh
menit. Selanjutnya, tabung tersebut disentrifugasi 13.000 rpm selama tiga menit pada temperatur ruang. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf 1,5 mL yang steril yang telah berisi 300 uL isopropanolol. Kemudian dibolak-balik sekitar tiga detik sampai terlihat benang DNA.
Selanjutnya, disentrifugasi 13.000 rpm selama satu menit, hingga tampak pellet putih. Supernatan dibuang dan ditambahkan 70 etanol sebanyak
300 uL. Kemudian, disentrifugasi 13.000 rpm selama satu menit. Etanol diaspirasi menggunakan pipet dengan hati-hati, lalu dikeringkan dengan
kipas angin sekitar satu jam. Selanjutnya, ditambahkan 100 uL DNA rehydration solution dan disimpan pada suhu 4
C selama satu malam. Besoknya disimpan ke freezer -20
3.8.5. Nested-polymerase chain reaction
C.
Nested-Polymerase Chain Reaction Nested-PCR dilakukan untuk memperoleh hasil sequencing secara langsung. Reaksi amplifikasi
Universitas Sumatera Utara
pertama dilakukan dengan menggunakan primer CCTACCCCTGCACCCCCAATAAATAAA dan CTTCCTGTCGAGTGCCC
CCTGCT. Volume reaksi adalah 10 mikroliter, dan untuk masing-masing
PCR, 30ng dari genomik DNA diamplifikasi dalam 3,5pmol dari setiap primer, 0,25U AmpliTaq Gold, 0,2mM dNTPs, 10 dimethyl sulfoxide, dan
2,5mM MgCl
2
. Diputar dengan temperatur 95 C selama sepuluh menit,
diikuti dengan 40 putaran pada temperatur 94 C selama lima belas detik,
didinginkan pada temperatur 68 C selama tiga puluh detik, dan diekstensi
pada temperatur 72
3.8.6. Sequencing
C selama satu menit. Reaksi kedua didapatkan dengan
menggunakan primer TGCCACTACTGCTGCTGCT dan ACCTTTCCCTCGATCACCAC. Hasil PCR di-sequencing secara
langsung setelah pembersihan hasil PCR dengan menggunakan Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit PE Biosystem.
Untuk mendapatkan “sequence lengkap SNP8NRG433E1006 gen NRG1”, terdapat beberapa tahapan. Pertama, produk Nested-PCR
dianalisis menggunakan mesin Applied Biosystems 3730 xl DNA Analyzer dengan protokol Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Chemistry.
Selanjutnya adalah pengolahan menggunakan perangkat lunak komputer. Perangkat lunak komputer digunakan untuk melakukan alignment
terhadap pra sequence forward dan pra sequence reverse. Tahapan mendapatkan sequence lengkap untuk masing-masing subjek penelitian
adalah sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
1. Kedua berkas pra sequence forward dan pra sequence reverse dibaca dengan perangkat lunak sequence scanner 1.0; Sequence scanner
adalah perangkat lunak yang diproduksi oleh Applied Biosystem. 2. Urutan nukleotida yang ada dari masing-masing berkas pra sequence
forward dan pra sequence reverse kemudian diektstrak dengan cara menyorot urutan nukleotida pada jendela “sequence” dari bp 1 sampai
bp maksimal yang ditampilkan tanpa mengurangi sedikitpun urutan nukleotida, kemudian urutan nukleotida yang disorot, di gandakan
copy dan di tempelkan paste pada “berkas catatan” file notepad kemudian disimpan masing-masing dengan ekstensi FASTA.
3. Untuk berkas catatan yang berisi sequence DNA yang dihasilkan dari ekstraksi berkas pra sequence reverse, dilakukan reverse complement
dengan cara menggunggah berkas catatan yang berisi sequence DNA yang dihasilkan dari ekstraksi berkas pra sequence reverse ke
http:bioinformatics.orgsmsrev_comp.html. Setelah proses unggah selesai, situs ini akan langsung menampilkan hasil proses reverse
complement. Hasil yang ditampilkan ini dinamakan “berkas catatan hasil reverse complement. Hasil yang ditampilkan pada situs ini,
kemudian disorot, digandakan, dan ditempelkan pada berkas catatan file notepad baru dan disimpan kembali dengan ekstensi FASTA.
4. Tahapan terakhir adalah melakukan alignment “berkas catatan” forward dengan “berkas catatan” hasil reverse complement. Tahapan ini
kembali menggunakan perangkat lunak BLAST Basic Local Allignment Search Tool yang disediakan oleh National Center of Biological
Universitas Sumatera Utara
Informatics NCBI yaitu pada http:blast.ncbi.nlm.nih.gov. Berkas catatan forward dan berkas catatan hasil reverse complement,
diunggah ke alamat situs tersebut, dan hasil alignment akan langsung ditampilkan dalam beberapa menit. Hasil yang ditampilkan pada situs
tersebut merupakan sequence lengkap SNP8NRG433E1006 gen NRG1.
3.9. Alur Penelitian
.
Gambar 3. 1. Alur Penelitian
3.10. Manajemen dan Analisis Data
Dalam menentukan hubungan antara SNP8NRG433E1006 gen NRG1
dengan skizofrenia dilakukan analisis frekuensi SNP8NRG433E1006 gen NRG1 dalam populasi yang bertujuan untuk
SNP8NRG433E1006 Nested-PCR
Izin Komite Etik FK-USU Suku Batak
Universitas Sumatera Utara
