Prosedur pengambilan darah Prosedur isolasi DNA

3.8.2. Prosedur pengambilan darah

Pengambilan darah dilakukan pada pukul 08.00–09.00 WIB. Dilakukan pembebatan pada lengan kiri subjek penelitian dengan torniquette, dibersihkan vena mediana kubiti dengan alcohol swab. Kemudian diambil darah sebanyak 4 cc dari vena mediana cubiti sinistra, 3cc dimasukkan ke dalam tabung EDTA 3cc dan 1 cc untuk pemeriksaan ELISA. Bekas pengambilan darah ditutup dengan pad. Dalam satu jam pengumpulan darah, darah dikoagulasikan pada temperatur 37 C. Serum dipisahkan melalui sentrifugasi pada temperatur 4 C selama lima belas menit dan disimpan pada suhu -80

3.8.3. ELISA

C sampai digunakan untuk dianalisis. Semua reagen dan sampel diletakkan pada ruangan dengan temperatur ruangan 18-25 o

3.8.3.1. Cara kerja

C sebelum digunakan. Selanjutnya, sampel didilusikan. Assay Diluent A Item D digunakan untuk dilusi sampel serumplasma. Assay Diluent B Item E satu kali digunakan untuk dilusi supernatan kultur selurine. Selanjutnya, Assay Diluent B 5X diencerkan dengan distilled water menjadi satu kali. Semua reagen diletakkan di dalam ruangan dengan temperatur ruang 18-25 o C sebelum digunakan. Kemudian, 100 µl dari setiap standar dan sampel ditambahkan ke dalam well. Well ditutup dan diinkubasi selama dua setengah jam pada temperatur ruang atau selama satu malam pada temperatur 4 o C dan digoncang perlahan. Selanjutnya, larutan tersebut dibuang dan dicuci sebanyak empat kali dengan satu kali Universitas Sumatera Utara menggunakan wash solution. Setiap well yang terisi wash buffer 300 µl dicuci dengan menggunakan multi-channel pipette atau autowasher. Setelah pencucian terakhir, sisa wash buffer dibuang dengan mengaspirasikannya. Kemudian, plate dibalikkan dan dibersihkan dengan menggunakan kertas tissue. Selanjutnya, 100 µl dari satu kali biotinylated antibody ditambahkan ke masing-masing well. Kemudian, diinkubasi selama satu jam pada temperatur ruang dengan menggoncangnya secara perlahan. Selanjutnya, larutan dibuang dan diulangi pencucian seperti sebelumnya. Kemudian, 100 µl HRP-Streptavidin ditambahkan ke masing- masing well. Kemudian, diinkubasi selama empat puluh lima menit pada temperatur ruang dengan menggoncangnya perlahan. Larutan tersebut dibuang dan diulangi pencucian seperti sebelumnya. Selanjutnya, 100 µl TMB One –step substrate reagent ditambahkan ke masing-masing well. Kemudian, diinkubasi selama tiga puluh menit pada temperatur ruang dalam keadaan gelap dengan menggoncangnya secara perlahan. Selanjutnya, 50 µl Stop Solution ditambahkan ke dalam masing-masing well. Kemudian, hasilnya dibaca dengan segera pada panjang gelombang 450 nm.

3.8.4. Prosedur isolasi DNA

Darah dimasukkan ke dalam tabung EDTA sebanyak 3 cc dengan diinjeksikan secara perlahan-lahan. Kemudian, tabung tersebut dibolak- balik perlahan agar darah bergabung dengan EDTA. Selanjutnya, disentrifus 3000 rpm selama 10-15 menit. Plasmanya dipisahkan dan diambil leukositnya sebanyak 300 mikroliter. Pada tabung eppendorf 1,5 Universitas Sumatera Utara mL lalu ditambahkan EL buffer 900 mikroliter, kemudian dibolak-balin secara perlahan. Tabung tersebut diinkubasi selama sepuluh menit di dalam kulkas dan selanjutnya disentrifus dalam 13000 rpm selama tiga menit. Supernatan dibuang secara hati-hati dan pelan-pelan agar endapannya tidak ikut terbuang. Hal ini diulangi sampai lima kali, sampai warna supernatan jernih dan endapan sudah berwarna putih. Setelah diperoleh endapan putih atau cairan sudah jernih, supernatan dibuang dan endapan divortex selama dua puluh detik. Selanjutnya, 300 uL nuclei lysis solution ditambahkan dan tabung dibolak-balik agar tercampur. Kemudian protein precipitation 100uL ditambahkan dan divortex selama dua puluh menit. Selanjutnya, tabung tersebut disentrifugasi 13.000 rpm selama tiga menit pada temperatur ruang. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 mL yang steril yang telah berisi 300 uL isopropanolol. Kemudian dibolak-balik sekitar tiga detik sampai terlihat benang DNA. Selanjutnya, disentrifugasi 13.000 rpm selama satu menit, hingga tampak pellet putih. Supernatan dibuang dan ditambahkan 70 etanol sebanyak 300 uL. Kemudian, disentrifugasi 13.000 rpm selama satu menit. Etanol diaspirasi menggunakan pipet dengan hati-hati, lalu dikeringkan dengan kipas angin sekitar satu jam. Selanjutnya, ditambahkan 100 uL DNA rehydration solution dan disimpan pada suhu 4 C selama satu malam. Besoknya disimpan ke freezer -20

3.8.5. Nested-polymerase chain reaction