Bahan dan Cara Kerja 1. Anamnese dan pemeriksaan fisik

• Tidak menderita penyakit ginjal kronik • Obat-obatan yang dikonsumsi dalam jangka waktu lama, terutama Glukokortikoid 6 bulan terutama prednison 7.5 mg hari 36 • Pekerjaan aktifitas sehari hari • Riwayat minum alkohol • Riwayat merokok 2. Dilakukan pemeriksan fisik,meliputi: • Berat badan dan tinggi badan, ditentukan dengan IMT • Pemeriksaan fisik untuk Wayne Indeks 3.Pemeriksaan Bone Mineral Density BMD dengan menggunakan alat Quantitative Ultrasound QUS untuk menilai kepadatan tulang. 4.Pengambilan sampel darah vena yang sebelumnya puasa selama 12 jam dipisahkan serumnya dilakukan pemeriksaan kreatinin darah dan sebagian dimasukkan kedalam aliquot dan disimpan dalam freezer -30º C sampai waktu pemeriksaan -CTx 5.Pemeriksaan kadar -CTx secara serentak terhadap sampel darah dari pasien-pasien yang masuk kriteria penelitian. 3.7. Bahan dan Cara Kerja 3.7.1. Anamnese dan pemeriksaan fisik Anamnese dilakukan dengan cara wawancara meliputi lama sudah menopouse berpedoman pada daftar pertanyaan pada status penelitian Soufni Morawati : Kadar -Cross-Links Telopeptide Pada Wanita Postmenopause Dengan Osteoporosis Atau Osteopoeni, 2009 dan pemeriksaan fisik meliputi tekanan darah dan pemeriksaan gangguan tiroid .seluruh data dan hasil pemeriksaan dicatat dalam status penelitian.

3.7.2. Pemeriksaan Bone Mineral Density BMD

Untuk pemeriksaan ini dilakukan memakai Quantitative Ultrasound dengan mendapatkan nilai T-score sebagai nilai dari kepadatan tulang.

3.7.3. Pengambilan dan pengolahan sampel darah

Pemeriksaan kadar -CTx menggunakan sampel darah vena yang sebelumnya puasa selama 12 jam. Sampel diambil dari penderita yang telah ditetapkan masuk dalam kelompok postmenopause dengan osteopeni atau osteporosis dan kelompok pramenopause tanpa osteopeni atau osteoporosis. Darah diambil sebanyak 5 cc, dari vena mediana cubiti, pasien malamnya puasa 10-12 jam. Darah dimasukkan dalam tabung tanpa antikoagulan. Setelah didiamkan selama lebih kurang 30 menit, kemudian disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Dari serum yang dipisahkan dilakukan pemeriksaan kreatinin darah, dan sebagian dimasukkkan dalam aliquot dan disimpan dalam freezer -30°C, sampai waktu untuk pemeriksaan -CTx. 31 Soufni Morawati : Kadar -Cross-Links Telopeptide Pada Wanita Postmenopause Dengan Osteoporosis Atau Osteopoeni, 2009 3.7.4. Pemeriksaan Sampel Darah 3.7.4.1 . Pemeriksaan -cross Laps 10,31 Dilakukan serentak setelah terkumpul sejumlah sampel. Dengan alat Cobas Elecsys 601 Cobas e 601, menggunakan metode Electrochemiluminescence sandwich immunoassay ECLIA. Sampel yang beku dicairkan pada suhu ruangan. Reagensia, kalibrator dan kontrol juga dibuat menjadi suhu ruangan 20-25°C, dan disiapkan menjadi larutan kerja sesuai petunjuk pada leaflet. Reagensia diletakkan pada disk reagensia, kalibrator pada disk sampel. Lakukan kalibrasi reagen. Letakkan kontrol dan sampel pada disk sampel. Lakukan pemeriksan sampel. Prinsip pemeriksaan ECLIA tahapan sebagai berikut : • Inkubasi pertama : antigen dari sampel 50 µL, antibodi biotinilasi poliklonal spesifik -CrossLaps dan antibodi monokonal spesifik - CrossLaps yang telah dilabel dengan kompleks ruthenium membentuk kompleks sandwich . • Inkubasi kedua : Setelah penambahan mikropartikel yang dilapisi oleh streptavadin terjadi kompleks antigen antibodi melalui interaksi biotin dan sterptavadin. • Gabungan reaksi ini diaspirasikan kedalam sel pengukur elektrokimia dimana substansi yang tidak terikat dicuci dan kemudian dipindahkan oleh buffrer procell. Sedangkan kompleks imun yang terbentuk ditangkap secara magnetis. Aplikasi dari voltase ke elektroda Soufni Morawati : Kadar -Cross-Links Telopeptide Pada Wanita Postmenopause Dengan Osteoporosis Atau Osteopoeni, 2009 kemudian menginduksi emisi cahaya chemiluminesncent yang diukur dengan photomultiplier. • Hasilnya ditentukan melalui kurva kalibrasi yang digenerasikan secara spesifik dengan instrumen dengan cara kalibrasi 2 titik terhadap kurva master yang tersedia melalai barcode reagensia. • Jumlah cahaya yang dihasilkan berbanding lurus dengan kadar analit dalam sampel. 31

3.7.4.2. Pemeriksaan kreatinin darah

35 Dilakukan dengan alat Automatic analyzer Cobas Integra 400 plus dan pemeriksaan kreatinin dengan metode Jaffe tanpa deproteinisasi. Prinsip reaksi adalah : pH Alkali Creatinin + picrid acid å complex creatinin picrid acid merah-oranye Kalkulasi konsentrasi analit secara otomatis dengan mengalikan faktor konversi : µmolL X 0,0113 = mgdL

3.7.5. Pemantapan Kualitas

Pemantapan kualitas dilakukan untuk menjamin ketepatan hasil pemeriksaan dalam batas yang dapat dipercaya valid. Sebelum dilakukan pemeriksaan harus dilakukan kalibrasi terhadap alat-alat yang digunakan agar penentuan konsentrasi zat yang belum diketahui seakurat mungkin Soufni Morawati : Kadar -Cross-Links Telopeptide Pada Wanita Postmenopause Dengan Osteoporosis Atau Osteopoeni, 2009 Kalibrasi autometic analyzer RohceCobas Integra 400 plus untuk pemeriksaan kreatinin menggunakan C.f.a.s calibrator for autometic system yang dilarutkan dengan 5 ml steril water . Kontrol kualitas menggunakan kontrol normal Precinom U dan. Kontrol kualitas dilakukan setiap hari pada setiap awal pemeriksaan sedang kontrol abnormal Precipath U yang dilakukan jika dadapati hasil yang tinggi dan tidak masuk dalam nilai kontrol. Tabel 1. Hasil Kontrol kualitas pemeriksaan kreatinin Pemeriksaan Nilai control Nilai target Range 14 -07-09 18-07-09 23-07-09 29-07-09 30-07-09 03-08-09 1,0 1,0 1,1 0,90 1,1 1,0 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 0,90-1,26 0,90-1,26 0,90-1,26 0,90-1,26 0,90-1,26 0,90-1,26 Nilai kontrol kualitas dalam 6 kali pemeriksaan kreatinin keseluruhanya berada pada batas yang dpat dierima acceptabel range 0,93-1,35 3.7.5.1.Kalibrasi Pemeriksaan -CrossLaps -CTx Kalibrasi pemeriksaan -CTx pada alat cobas e 601 analyzers menggunakan calset Elecsys -CTx Cat.No 11776576 terdiri dari kalibrator 1 CROSSL Cal 1, kalibrator 2 CROSSL Cal 2, dalam 2 nilai target Soufni Morawati : Kadar -Cross-Links Telopeptide Pada Wanita Postmenopause Dengan Osteoporosis Atau Osteopoeni, 2009 konsentrasi . Nilai kadar kalibrator spesifik lot dicantumkan dalam kode barcode dan juga dicetak pada lembaran barcode kalibrator Kedua kalibrator sudah siap pakai menjadi larutan kerja yang disimpan dalam botol kusus CalSet vial Prinsip kalibrasi adalah mengukur 2 kalibrator dan Analyzer akan mencocokkan dengan kurva master. Kurva master kalibrasi dibuat oleh pabrik Roche Diagnostic sewaktu memproduksi reagen, yang dikodekan dalam barcode 2 dimensi sesuai dengan kemasan reagen kemudian informasi ini akan ditransferkan ke analyzer Selama penelitian kalibrasi hanya dilakukan satu kali pada waktu membuka reagen, dengan hasil sebagai berikut: Tabel 2. Hasil Kalibrasi Kalibrator -CTx Test Module Calibration type Unit Date Calibration lot Regent lot CrossL E-2 Rodbard ngmL 01082009 15112201 00182353 L-Calibrasi. Was generated Level 1 Level 2 Target Range Target Signal 1 Signal 2 Monotomy Diff Dupl Sys.Err 0,05 1933 1796 - - - - 1,83 16527 15271 - - - - 0,05 0,05 -2,0 Factor 1,00 Soufni Morawati : Kadar -Cross-Links Telopeptide Pada Wanita Postmenopause Dengan Osteoporosis Atau Osteopoeni, 2009 3.7.5.2.Kontrol Kualitas Pemeriksaan -CTx Kontrol kualitas menggunakan PreciControl Bone Cat.No.03142949 yang mengandung serum control lyophilized dengan bahan dasar serum kuda memakai 3 nilai konsentrasi PC BONE1, PC BONE2, PC BONE 3. PreciContol bone dibuat menjadi larutan kerja, dengan melarutkan setiap botol dengan menambahkan 2,0 ml steril water, dan dibiarkan selama 15 menit hingga larut dan dicampur dengan hati hati untuk menghindari terbentuknya gelembung 3 . Nilai rentang target dari pabrik Roche digunakan untuk memantau akurasi pemeriksaan -Ctx pada Cobas e 601. Hasil pemeriksaan precicontrol adalah sebagai berikut: Tabel 3.Hasil Kontrol Kualitas Pemeriksaan Kadar -CTx Date R.lot No. PC BONE 1 Target Range PC BONE 2 Target PC BONE 3 Target 0182009 1882009 00182353 00182353 0,296 0,319 0,315 ± 2SD 0,759 0,786 0,75 ± 2SD 3,08 3,11 3,0 ± 2SD Selama penelitian kontrol kualitas dilakukan sebanyak 2 kali bersamaan dengan sampel yang diperiksa. Dalam 2 kali pemeriksaan sampel, nilai kontrol PC-BONE 1, PC-BONE 2 dan PC BONE 3 tidak melewati nilai target yang diharapkan Garfik 2 Soufni Morawati : Kadar -Cross-Links Telopeptide Pada Wanita Postmenopause Dengan Osteoporosis Atau Osteopoeni, 2009 Grafik 2. Nilai kualitas kontrol kadar - CTx

3.8. Analisa data