BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2013 – November 2013. Penelitian ini
dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah erlenmeyer, gelas ukur, pipet serologi, pH-meter, autoklaf, entkas, rak kultur yang dilengkapi dengan lampu
flourescent neon 500 lux, laminar air flow, kertas saring, alumunium foil, propipet, botol kultur, alat diseksi, beaker glass, neraca digital, handspayer, bunsen,
cawan petri, pinset, dan pisau, shaker, plastik dan karet. Bahan dalam penelitian ini meliputi tunas apikal kelapa sawit Elaeis
guineensis Jacq. berumur 8 bulan yang berasal dari Pusat Penelitian Kelapa Sawit Marihat, larutan Na-hipoklorit, fungisida, alkohol 70, akuades, HgCl
2
, betadin, asam askorbat, BAP, 2,4-D, agar-agar, gula, hara makro dan hara mikro, arang
aktif, tween 80, bahan- bahan penyusun media MS, NaOH 0,1N, HCl 0,1N.
a b
Gambar 3.1. a. Pohon Kelapa Sawit; b.Tunas Apikal Kelapa Sawit
Universitas Sumatera Utara
3.3 Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan 2 faktorial.
Faktor tingkat variasi 2,4-D A terdiri dari 4 taraf, yaitu: A
0 =
konsentrasi 0 ppm A
1 =
konsentrasi 110 ppm A
2 =
konsentrasi 120 ppm A
3 =
konsentrasi 130 ppm Faktor tingkat variasi BAP B terdiri dari 4 taraf, yaitu:
B
0 =
konsentrasi 0 ppm B
1 =
konsentrasi 0,17 ppm B
2 =
konsentrasi 0,23 ppm B
3 =
konsentrasi 0,29 ppm Dengan demikian diperoleh 16 kombinasi perlakuan
A B
A B
1
A B
2
A B
3
A
1
B A
1
B
1
A
1
B
2
A
1
B
3
A
2
B A
2
B
1
A
2
B
2
A
2
B
3
A
3
B A
3
B
1
A
3
B
2
A
3
B
3
Setiap perlakuan dilakukan sebanyak 3 ulangan terdiri dari 16 perlakuan. Jumlah satuan botol kultur adalah 16 x 3 = 48 botol
3.4 Cara Kerja 3.4.1 Sterilisasi Alat
Seluruh alat gelas dan alat diseksi dicuci dengan bersih dan dikeringkan. Alat-alat tersebut dibungkus kertas dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
C dengan tekanan 15 psi selama 60 menit. Bersamaan dengan itu akuades dalam erlenmeyer
yang telah ditutup dengan alumunium foil juga ikut disterilkan. Alat disimpan di ruang pemeliharaan kultur yang telah aseptik dengan cara disemprot setiap hari
dengan menggunakan alkohol 70. Suhu ruangan tetap dijaga berkisaran 25 C
dengan pengaturan AC.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Pembuatan Media
Media yang digunakan pada tahap inisiasi dan tahap multiplikasi adalah media MS yang diberi perlakuan dengan penambahan BAP pada konsentrasi 0, 110, 120, dan
130 ppm dikombinasi dengan 2,4-D pada konsentrasi 0, 0,17, 0, 23, dan 0,29 ppm,. Tahap awal pembuatan media adalah pembuatan media adalah pembuatan larutan
stok, yang terdiri dari stok hara mikro, mikro, myo-inositol, iron, vitamin, BAP dan 2,4-D. Sukrosa, agar, dan arang aktif ditimbang langsung sesuai kebutuhan tanpa
harus dijadikan larutan stok. Media yang digunakan sebanyak 1,6 liter. Pembuatan larutan MS dengan
cara memasukan hara makro, iron, vitamin, sukrosa ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan akuades hingga 100 ml kemudian ditambahkan akuades dibuat sampai
volume 1000 ml, Larutan dibagi ke 16 perlakuan yang setiap perlakuan berisi 100 ml. Selanjutnya untuk setiap perlakuan dimasukkan BAP dan 2,4-D. Derajat
keasaman media diukur pada setiap perlakuan dengan menggunakan pH meter 5,8. Untuk menetralkan pH ditambahkan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N.
Setiap perlakuan media ditambahkan 0,8 gram agar, 3 gram gula, dan 0,3 gram arang aktif sambil dimasak. Media dimasukkan ke dalam botol-botol kultur,
mulut botol kultur ditutup alumunium foil, dilapisi plastik kemudian diikat dengan karet. Botol-botol disterilkan dengan autoklaf pada tekanan 15 psi, pada suhu 121
C selama 30 menit, setelah selesai kemudian disimpan dalam rak kultur dalam
ruangan AC.
3.4.3 Sterelisasi Bahan
Eksplan berupa tunas apikal kelapa sawit dipotong dan dicuci dengan air kran mengalir dan dibilas dengan akuades steril hingga bersih. Tunas apikal direndam
dalam larutan fungisida 0,2g 100 ml yang ditambahkan tween 80 sebanyak 2 tetes selama 30 menit dan dibilas dengan akudes steril sebanyak 2 kali. Tunas direndam
dalam HgCl
2
0,1 selama 5 menit dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali. Sterilisasi dilanjutkan dengan merendam eksplan dalam larutan Na-hipoklorit
0,5 selama 10 menit. Tunas pucuk dicuci dengan akuades steril sebanyak 2 kali. Eksplan disterilkan dengan Na-hipoklorit 1 selama 10 menit. Tunas apikal dibilas
Universitas Sumatera Utara
dengan akuades sebanyak 3 kali. Selanjutnya eksplan diletakkan ke dalam cawan petri dan dikeringkan dengan kertas saring steril
3.4.4 Penanaman Eksplan
Ruangan dalam keadaan bersih sebelum melakukan penanaman. Penanaman dilakukan di dalam Entkas yang telah disterilkan dengan UV. Alat-alat diseksi,
lampu bunsen dan alkohol 70 dipersiapkan terlebih dahulu. Salah satu sisi tunas apikal dipotong satu per satu ditanam dalam media. Botol media hanya diisi oleh
satu eksplan tunas apikal saja. Setelah selesai digunakan, pisau dicelupkan ke dalam alkohol 96 lalu dibakar bagian pisau yang akan memotong eksplan agar pisau
tersebut steril. Botol berisi eksplan kemudian ditutup dengan alumunium foil, dilapisi plastik dan diikat dengan karet.
a b
d c
Gambar 3.2. a. Media MS; b. Eksplan tunas apikal; c. Tunas apikal yang telah siap ditanam; d. Penanaman eksplan ke dalam botol yang berisi
media
Universitas Sumatera Utara
3.4.5 Pemeliharaan Eksplan
Botol kultur yang telah berisi eksplan diletakan pada rak kultur dengan kondisi ruangan yang steril. Intensitas cahaya dengan penyinaran lampu neon 500 lux.
Botol-botol berisi eksplan tersebut disusun dengan rapi sehingga memudahkan dalam pengamatan. Ruangan diupayakan dalam keadaan steril atau dengan
penyemprotan alkohol 70 setiap harinya.
3.4.6 Variabel Pengamatan
Pengamatan dilakukan setiap minggu. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah:
a. Waktu tumbuh kalus
b. Persentasi kultur yang membentuk kalus
Persentasi kultur membentuk kalus = Jumlah eksplan yang berkalus Jumlah botol seluruh perlakuan
c. Berat basah kultur g
d. Warna kalus
e. Persentasi kalus embriogenik
Persentasi kalus embriogenik = Jumlah kalus embriogenik Jumlah botol seluruh perlakuan
3.5 Analisis Data
Data dianalisis dengan Analisis of Variance ANOVA. Jika perbedaan yang nyata p0,05, dilanjutkan dengan Uji Duncan New Mutiple Range DNMRT
Sasatrosupadi, 2004. x 100
x 100
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1.Persentase Kultur Yang Membentuk Kalus
Tabel pengamatan kultur yang membentuk kalus dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 31. Dari hasil pengamatan, persentase kultur yang membentuk kalus
adalah 34 botol dari 48 botol atau 75. Pembentukan kalus rata-rata terjadi pada minggu ke-7. Persentase kultur yang membentuk kalus dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1. Persentase Kultur Yang Membentuk Kalus ZPT
Sitokinin B Jumlah
Auksin A B
B
1
B
2
B
3
A -
- -
- -
A
1
3 3
3 3
12 100
100 100
100 100
A
2
3 3
3 3
12 100
100 100
100 100
A
3
3 3
3 3
12 100
100 100
100 100
Jumlah
9 9
9 9
75 75
75 75
Keterangan: A 0 ppm 2,4-D, A
1
110 ppm 2,4-D, A
2
120 ppm 2,4-D, A
3
130 ppm 2,4-D. B
0 ppm BAP, B
1
0,17 ppm BAP, B
2
0,23 ppm BAP, B
3
0,29 ppm BAP Berdasarkan Tabel 4.1. dapat dilihat bahwa persentase kultur yang
membentuk kalus terdapat pada perlakuan A
1
B
0,
A
1
B
1,
A
1
B
2,
A
1
B
3,
A
2
B
0,
A
2
B
1,
A
2
B
2,
A
2
B
3,
A
3
B
0,
A
3
B
1,
A
3
B
2,
dan A
3
B
3.
Hal ini disebabkan karena kombinasi antara auksin dan sitokinin yang tepat dapat menginduksi pertumbuhan kalus. Menurut
George Sherrington 1984, hormon 2,4-D adalah golongan auksin yang sangat baik untuk memacu pertumbuhan kalus karena aktivitasnya yang kuat pada proses
dediferensiasi sel, menekan organogenesis serta menjaga pertumbuhan kalus. Apabila dibandingkan dengan auksin lainnya seperti IAA, 2,4-D menunjukan
aktivitas yang kuat. Menurut Wattimena 1988, Aktivitas 2,4-D yang kuat dan optimal ini disebabkan karena gugus karboksil yang dipisahkan oleh karbon dan
oksigen. Benzil amino purin umumnya digunakan dalam proses regenerasi kultur
Universitas Sumatera Utara