Jenis dan Rancangan penelitian Analisis Hasil

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan penelitian

Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah Piper crocatum Ruiz Pav terhadap kultur sel Raji ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel Bebas Konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yaitu 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µgml. b. Variabel Tergantung Persentase kematian sel Raji. c. Variabel Pengacau Terkendali i. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun sirih merah pada tempat dan waktu yang sama. ii. Medium tumbuh sel Raji dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum.

2. Definisi Operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji. 14 b. LC 50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu membunuh atau dapat menyebabkan kematian sejumlah 50 sel uji sel Raji dan dinyatakan dalam µgml. c. Ekstrak etanolik daun sirih merah adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi dengan penyari etanol 70.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat - alat gelas, timbangan analitik Mettler Toledo, alumunium foil, tabung conical Nunc, autoklaf, tissue culture flask Nunc, swing rotor centrifuge, inkubator inco 2 memmert, mikropipet, lemari pendingin Sharp, cell counter togoshiseiki, 96-well plate Nunc, laminar air flow Labconco, inverted microscope Olympus IMT-2, mikroskop Olympus, haemocytometer Neubauer Improved, tissue, glove, masker, waterbath, yellow tip, blue tip, effendorf, blender, oven, ayakan.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. Daun sirih merah b. Kultur sel Raji yang diambil dari stok Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu LPPT Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. c. Etanol 70 bahan penyari daun sirih merah d. Dimethyl Sulfoxide DMSO, Sigma e. Trypan blue f. Aquabidest g. Media pencuci: RPMI 1640 Gibco, natrium bikarbonat, Hepes h. Media penumbuh: RPMI 1640 Gibco, FBS Foetal Bovine Serum 10Gibco, Penisilin Streptomisin 2 Gibco, dan Fungison 0,5 Gibco.

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih merah yang telah dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer dan Brink 1965.

2. Pengumpulan Daun Sirih Merah

Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian diambil dari daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa Tengah.

3. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah

Daun sirih merah segar dicuci menggunakan air mengalir dan ditiriskan sehingga sisa air menghilang. Untuk proses pengeringan digunakan oven pada suhu 60 – 70 °C. Hasil pengeringan diserbuk menggunakan blender dan diayak dengan pengayak 0,75 mm. Serbuk yang diperoleh disimpan dalam botol berwarna coklat.

4. Sterilisasi Alat

Alat – alat yang akan digunakan dicuci bersih menggunakan deterjen, dibilas menggunakan air mengalir dan dikeringkan. Masing – masing dibungkus menggunakan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121°C dengan tekanan 2,05 abs bar Hagman, 2005.

5. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Serbuk kering daun sirih merah ditimbang sebanyak 100 gram kemudian dimaserasi menggunakan 700 ml larutan penyari etanol 70. Kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah 24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya, rendaman harus dikocok berulang-ulang kira-kira 3x sehari. Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65 o C dibantu dengan kipas angin hingga diperoleh ekstrak kental.

6. Pembuatan larutan uji

Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100 mgml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µgml, 500 µgml, 750 µgml, 1000 µgml, 1250 µgml, 1500 µgml, 1750 µgml, dan 2000 µgml.

7. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh

a. Pembuatan medium pencuci

RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambahkan 2,3 gram natrium bikarbonat dan 2 gram Hepes, diencerkan sampai diperoleh volume 100 ml, pH dibuat 7,2 dan larutan disterilkan dengan menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.

b. Pembuatan medium penumbuh RPMI 1640-serum

Dibuat suatu campuran antara 10 ml FBS Foetal Bovine Serum, 2 ml penisilin – streptomisin dan 0,5 ml fungison, ditambahkan RPMI 1640 sehingga diperoleh volume 100 ml. Larutan disterilkan dengan menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.

8. Preparasi Kultur Sel Raji

a. Propagasi Sel Raji

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37°C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37°C dengan aliran 5 CO 2 dari udara. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.

b. Panen Sel Raji

Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3,0x10 4 100 µl.

9. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah dengan

Menggunakan Metode Direct Counting Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel Raji dengan kepadatan 3,0x104100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate kemudian diberikan 100 µl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µgml pada masing – masing sumuran. Sebagai kontrol, digunakan 200 μl suspensi sel dalam media penumbuh . Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C, dalam inkubator dengan aliran CO 2 5 dari udara. Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi bersama 50 μl trypan blue, diambil sebanyak 10 μl dan dimasukkan dalam haemocytometer, diletakkan di bawah mikroskop kemudian dihitung jumlah sel hidup dan mati menggunakan cell counter.

E. Analisis Hasil

Prosentase kematian sel hasil perlakuan dihitung menggunakan rumus sebagai berikut : Kematian sel = 100 A × Β − Α Keterangan : A = Jumlah sel hidup pada sumuran kontrol media B = Jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan Distribusi data diuji menggunakan Kolmogorov-Smirnov. Untuk mengetahui perbedaan antara kontrol dan perlakuan digunakan one-way Anova dengan taraf kepercayaan 95. Nilai LC 50 dihitung dengan menggunakan analisis probit.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Tujuan dari determinasi ini adalah untuk memberikan kepastian terhadap kebenaran tanaman yang hendak diuji yaitu sirih merah, sehingga menghindari kekeliruan penggunaan bahan dengan tanaman lain. Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer dan Brink 1965. Hasil yang didapatkan dari determinasi menyatakan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah sirih merah Piper crocatum Ruiz Pav.

B. Pengumpulan Daun Sirih Merah

Pada penelitian ini digunakan daun sirih merah yang diambil dari daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa Tengah, pada bulan September 2007. Pemanenan dilakukan pada tanaman di tempat dan waktu yang sama, hal ini dimaksudkan untuk penyeragaman kandungan kimia atau meminimalkan variasi kandungan kimia. Daun sirih merah dipilih pada keadaan tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda yaitu pada tanaman yang berumur 4 bulan dan daunnya berumur 1 bulan, dengan tujuan mendapatkan kandungan senyawa yang optimal. Untuk menjaga kualitas daun yang dipakai maka dipilih daun yang tebal, segar dan berwarna terang kemudian dicuci di bawah air mengalir untuk memastikan daun sirih merah bersih dari kotoran seperti debu dan serangga yang menempel. 21