13
BAB III METODOLOGI
3.1 Tempat dan Waktu Pengujian
Pengujian cemaran mikroba pada kembang gula lunak bukan jelly dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Pengawas Obat dan
Makanan BBPOM di Medan yang berada di Jalan Willem Iskandar, Pasar V Barat I No. 2 Medan pada tanggal 10 Februari 2015 sd 16 Februari 2015.
3.2 Alat
Alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, autoklaf, cawan petri, inkubator, laminar air flow, mixer, oven, pipet volume, tabung durham dan
timbangan analitik.
3.3 Bahan
Bahan yang digunakan adalah Buffered Pepton Water BPW, kloramfenikol, Mac Conkey Broth MCB, Pepton Dilution Fluid PDF, Pepton
Dilution Agar PDA, Plate Count Agar PCA, dan TTC Tryphenyltetrazolium Chloride.
3.4 Sampel
Sampel yang digunakan adalah kembang gula lunak bukan jelly yang beredar di pasaran.
14
3.5 Pereaksi
Pereaksi yang digunakan adalah TTC Triphenyltetrazolium Chloride sebanyak 1 dari jumlah media PCA dan kloramfenikol sebanyak 0,01 dari
jumlah media PDA.
3.6 Prosedur Kerja 3.6.1 Sterilisasi Alat
1. Dicuci bersih alat dengan merendamnya di dalam air sabun selama 24 jam,
kemudian dibilas. 2.
Dikeringkan alat. 3.
Dibungkus dengan kertas perkamen lalu disterilisasi kering untuk alat-alat gelas dengan menggunakan oven pada suhu 170
o
C selama 4 jam sedangkan yang memerlukan sterilisasi basah untuk media serta bahan-
bahan lainnya disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 3 jam.
3.6.2 Pembuatan Media
Pembuatan media yang digunakan untuk seluruh parameter dalam pengujian yaitu:
Tabel 3.1 Pembuatan Media
Nama Media Berat gram
Aquadest ml Potato Dextrose Agar
PDA 3
1000
Plate Count Agar PCA 22,5
1000 Buffered Peptone Water
BPW 22,5
1000
15
Peptone Dilution Fluid PDF
1 1000
Mac Conkey Broth MCB
35 1000
1. Ditimbang serbuk media lalu masukkan ke dalam erlenmeyer.
2. Dilarutkan dengan aquadest.
3. Ditambahkan kloramfenikol sebanyak 0,01 gram untuk 100 ml PDA dan
ditambahkan TTC sebanyak 1 dari jumlah media PCA. 4.
Ditutup ujung erlenmeyer dengan menggunakan pendopol, lalu dihomogenkan.
5. Dipanaskan media hingga agak mengental.
6. Disterilisasi media dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 3 jam.
3.6.3 Angka Lempeng Total ALT
• Homogenisasi Sampel
Dengan cara aseptik ditimbang 25 gram sampel dan dimasukkan ke dalam pengencer besar yaitu BPW sebanyak 225 ml di dalam erlenmeyer, kemudian
dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10
-1
.
• Pengenceran
Disiapkan satu tabung yang telah diisi dengan 9 ml BPW. Hasil dari homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 10
-1
dipipet sebanyak 1 ml ke dalam tabung tersebut kemudian dihomogenkan hingga
diperoleh pengenceran 10
-2
.
16
• Inokulasi dan Inkubasi
Dari setiap pengenceran dipipet 1 ml ke dalam cawan petri yang sudah steril, dibuat duplo dan disiapkan cawan petri berisi media saja sebagai kontrol.
Ke dalam setiap cawan petri dituangkan 15 ml media PCA yang telah ditambahkan TTC sebanyak 1 suhu ± 45
o
C. Cawan petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata, biarkan hingga memadat
kemudian diinkubasi pada suhu 35 – 37
o
C selama 24 – 48 jam dengan posisi dibalik.
• Pengamatan
Setiap 24 jam koloni yang tumbuh di cawan petri diamati dan dihitung jumlah koloninya.
3.6.4 Angka Kapang Khamir AKK • Homogenisasi Sampel
Dengan cara aseptik ditimbang 25 gram sampel dan dimasukkan ke dalam pengencer besar yaitu PDF sebanyak 225 ml di dalam erlenmeyer, kemudian
dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10
-1
.
• Pengenceran
Disiapkan satu tabung yang telah diisi dengan 9 ml PDF. Hasil dari homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 10
-1
dipipet sebanyak 1 ml ke dalam tabung tersebut kemudian dihomogenkan hingga
diperoleh pengenceran 10
-2
.
17
• Inokulasi dan Inkubasi
Dari setiap pengenceran dipipet 0,5 ml ke dalam cawan petri yang telah diisi dengan media PDA + kloramfenikol, dibuat duplo dan disiapkan cawan petri
berisi PDA + kloramfenikol sebagai kontrol. Cawan petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata kemudian diinkubasi
pada suhu 20 - 25
o
C dan diamati pada hari ketiga dan keenam.
• Pengamatan
Pada hari ketiga dan keenam koloni kapang dan khamir yang tumbuh di cawan petri diamati dan dihitung. Koloni kapang seperti kapas atau bulat dengan
berbagai warna, permukaan kasar dan koloni khamir memiliki bentuk bulat kecil, putih, hampir menyerupai bakteri.
3.6.5 Angka Paling Mungkin APM Coliform
• Homogenisasi Sampel
Dengan cara aseptik ditimbang 25 gram sampel dan dimasukkan ke dalam pengencer besar yaitu PDF sebanyak 225 ml di dalam erlenmeyer, kemudian
dihomogenkan sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10
-1
.
• Pengenceran
Disiapkan dua tabung yang telah diisi dengan 9 ml MCB. Dipipet 1 ml dari pengenceran 10
-1
lalu dibuat pengenceran sampai 10
-3
kedalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml PDF, lalu dihomogenkan. Untuk setiap pengenceran
disiapkan 3 tabung reaksi berisi 9 ml MCB. Ke dalam tiap tabung dari masing- masing seri dimasukkan 1 ml suspensi pengencer lalu masukkan tabung durham
ke dalam tiap tabung tersebut. Diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 – 48 jam.
18
• Pengamatan
Setelah 24 jam diamati adanya gas yang terbentuk dalam tiap tabung, kemudian inkubasi dilanjutkan hingga 48 jam dan dicatat tabung-tabung yang
menunjukkan uji positif.
19
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Berdasarkan pengujian yang dilakukan yaitu uji cemaran mikroba pada
kembang gula lunak bukan jelly diperoleh hasil sebagai berikut:
1. Hasil pengujian Angka Lempeng Total ALT untuk kembang gula lunak
bukan jelly adalah 4,5 x 10
1
kolonig memenuhi syarat. 2.
Hasil pengujian Angka Kapang Khamir AKK untuk kembang gula lunak bukan jelly adalah 11 x 10
1
kolonig memenuhi syarat. 3.
Hasil pengujian Angka Paling Mungkin APM Coliform untuk kembang gula lunak bukan jelly adalah 3 APMg memenuhi syarat.
Tabel 4.1 Hasil Pengujian
Parameter Uji Hasil
Persyaratan SNI Keterangan
Angka Lempeng Total ALT
4,5 x 10
1
kolonig Maksimal 5 x 10
2
kolonig Memenuhi syarat
Angka Kapang Khamir AKK
11 x 10
1
kolonig Maksimal 2 x 10
2
kolonig Memenuhi syarat
Angka Paling Mungkin APM
Coliform 3 APMg
Maksimal 20 APMg
Memenuhi syarat
20
Tabel 4.2 Data Hasil Pengujian Angka Lempeng Total ALT
Tanggal Volume
Pengenceran ml
Media Inkubasi
Pengamatan Suhu
o
C Waktu
jam Cawan
I Cawan
II Total
110215 1 10
-1
1 10
-2
PCA PCA
35-37 35-37
24 24
2 1
1 -
3 1
120215 10
-1
10
-2
PCA PCA
35-37 35-37
24 24
5 1
4 1
9 2
Tabel 4.3 Data Hasil Pengujian Angka Kapang Khamir AKK
Tanggal Volume
Pengenceran ml
Media Inkubasi
Pengamatan Suhu
o
C Waktu
hari Cawan I Cawan II
Total
130215 0,5 10
-1
0,5 10
-2
PDA PDA
20-25 20-25
3 3
5 1
5 -
10 1
160215 10
-1
10
-2
PDA PDA
20-25 20-25
6 6
5 1
6 1
11 2
160215 Blanko: -Media
-Pengencer PDA
PDF 20-25
20-25 6
6 -
- -
- -
-
21
Tabel 4.4 Data Hasil Pengujian Angka Paling Mungkin APM Coliform
Tanggal Volume
Pengenceran ml
Media Inkubasi
Pengamatan Suhu
o
C Waktu
jam Tabung
I Tabung
II Tabung
III 110215 Uji Praduga:
10
-1
10
-2
10
-3
MCB MCB
MCB 37
37 37
24 24
24 120215 10
-1
10
-2
10
-3
MCB MCB
MCB 37
37 37
48 48
48 120215 Blanko:
-Media -Pengencer
MCB PDF
37 37
48 48
- -
- -
- -
4.2 Pembahasan