Alat Bahan Pembuatan Ekstrak

BAB III METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia, Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Farmasetika Dasar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan. Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental parametrik.Identifikasi tumbuhan dan karakterisasi simplisia dilakukan sebelum pembuatan ekstrak etanol buah belimbing wuluh, kemudian dilanjutkan dengan pembuatan ekstrak etanol buah belimbing wuluh secara maserasi, pembuatan sediaan gel dari ekstrak etanol buah belimbing wuluh, evaluasi stabilitas sediaannya dan pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol buah belimbing wuluh Averrhoa bilimbi Linn. dan sediaan gel ekstrak etanol buah belimbing wuluh terhadap bakteri Propionibacterium acne dan Staphylococcus epidermidis dengan metode difusi agar menggunakan pencadang kertas.

3.1 Alat

Alat-alat yang digunakan adalah: spektrofotometer Visibel Dynamica Halo Vis- 10,laminar airflow cabinet Astec HLF 1200 L,oven Gallenkamp, autoklaf Fison, inkubator Memmert, lemari pendingin Toshiba, neraca kasar Ohanus, neraca analitik Mettler AE 200, mikroskop, pH meter Trans Instrumen, viskometer bola jatuh Haake 597 Gerbruder Berlin, stopwatch, rotary evaporatorHaake D, freeze dryer Modulio, blender, alat maserasi, alat penetapan kadar air, lemari pengering, jarum ose, bunsen, mikro pipet Eppendorf, pipet tetes, bola karet, alumunium foil, kertas perkamen, tissu, Universitas Sumatera Utara pencadang kertas, cawan petri, kapas steril, jangka sorong, mortir, stamfer, spatula dan peralatan gelas di laboratorium.

3.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk simplisia buah belimbing wuluh Averrhoa bilimbi Linn., etanol 80, air suling, larutan kloralhidrat, toluen, HPMC 4000, propilenglikol, metil paraben, propil paraben, bakteri uji: Propionibacterium acne ATCC 6919, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, media nutrient agar NA, media nutrient brooth NB. Bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa, kecuali dinyatakan lain: alfa naftol, asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, asam asetat glasial, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, etanol, etilasetat, n-heksan, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat dan toluena. 3.3 Penyiapan Sampel 3.3.1 Pengumpulan sampel Pengambilan bahan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang diambil adalah buah belimbing wuluh yang masih segar, bewarna hijau kekuningan dan ukuran buahnya ± 6 cm. Sampel yang digunakan adalah buah belimbing wuluh Averrhoa bilimbi Linn. yang diperoleh dari Desa Glugur Rimbun, Kecamatan Pancur Batu, Kabupaten Deli Serdang, Provinsi Sumatera Utara. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Identifikasi sampel

Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Medanese MEDA, Universitas Sumatera Utara.

3.3.3 Pengolahan sampel

Buah belimbing wuluh Averrhoa bilimbi Linn. yang telah dikumpulkan sebanyak 10 kg dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan kemudian dipotong secara melintang. Buah ini dikeringkan di lemari pengering pada suhu 40-60 C hingga kering, dimana jika simplisia tersebut sudah kering bila diremas akan hancur, simplisia ditimbang sebagai berat kering, kemudian simplisia diserbuk menggunakan blender, disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat dan terlindung dari panas dan sinar matahari.Serbuk simplisia yang diperoleh sebanyak 600 g.

3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam. 3.4.1 Pemeriksaan makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan pada buah belimbing wuluh Averrhoa bilimbi Linn. dengan mengamati morfologi luar tumbuhan. Universitas Sumatera Utara

3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia buah belimbing wuluh. Sedikit serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.

3.4.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan terhadap serbuk simplisia buah belimbing wuluh untuk mengetahui kadar air yang terkandung dalam buah belimbing wuluh. Sebelum serbuk simplisia dimasukkan ke dalam labu, toluen terlebih dahulu dijenuhkan dengan cara sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml, lalu ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, lalu kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, selanjutnya tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992. Universitas Sumatera Utara

3.4.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Penetapan kadar sari larut dalam air dilakukan terhadap serbuk simplisia buah belimbing wuluh untuk mengetahui kadar senyawa-senyawa larut dalam air yang terdapat pada serbuk simplisia buah belimbing wuluh. Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata, yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.

3.4.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol

Penetapan kadar sari larut dalam etanol dilakukan terhadap serbuk simplisia buah belimbing wuluh untuk mengetahui kadar senyawa-senyawa larut dalam pelarut etanol yang terdapat pada serbuk simplisia buah belimbing wuluh. Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata, yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen Universitas Sumatera Utara sari yang larut dalam etanol 95 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.

3.4.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.

3.4.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

Senyawa-senyawa mineral hasil pemijaran yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.

3.5 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia serbuk simplisia buah belimbung wuluh meliputi: pemeriksaan senyawa alkaloid, glikosida, saponin, flavonoid, antrakinon, tanin dan steroidtriterpenoid. Universitas Sumatera Utara

3.5.1 Pemeriksaan Alkaloid

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada tabung: a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit 2 tabung reaksi dari percobaan diatas Ditjen POM, 1989.

3.5.2 Pemeriksaan Glikosida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3bagian volum air suling ditambah dengan 10 ml asam klorida 2N.Direfluks selama 30 menit, lalu didinginkan dan disaring.Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4M, lalu dikocok selama 5 menit dan disaring.Filtrat disari dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 C.Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut, yaitu 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diuapkan di penangas air. Sisa dilarutkan dalam 2 ml air suling dan 5 tetes pereaksi Molish, Universitas Sumatera Utara kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat.Glikosida positif jika terbentuk cincin ungu Ditjen POM, 1979.

3.5.3 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1- 10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin Ditjen POM, 1979.

3.5.4 Pemeriksaan Flavonoid

Sebanyak 10 g sebuk simplisia kemudian ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, filtrat yang diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu di tambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.5.5 Pemeriksaan Antrakinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambahkan 5 ml asam sulfat 2N, dipanaskan sebentar, dinginkan. Tambahkan 10 ml benzena, kocok, diamkan.Pisahkan lapisan benzen, saring, filtrat berwarna kuning, menunjukkan adanya antrakinon.Kocok lapisan benzena dengan 1-2 ml natrium hidroksida 2N, diamkan; lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Ditjen POM, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.5.6 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Filtrat yang diperoleh, diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida.Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Ditjen POM, 1979.

3.5.7 Pemeriksaan Steroidtriterpenoid

Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan n-heksan selama 2 jam, lalu disaring.Filtrat diuapkan dalam cawan penguap, pada sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat.Timbul warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul warna merah, pink atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Farnsworth, 1966.

3.6 Pembuatan Ekstrak

Serbuk simplisia diekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 80. Cara kerja: Sebanyak 600 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah gelas berwarna gelap lalu dimaserasi dengan 750 ml pelarut etanol 80 selama 5 hari terlindung dari cahaya matahari sambil sering diaduk, kemudian diserkai, diperas, lalu ampas ditambahkan cairan penyari secukupnya sehingga diperoleh seluruh maserat sebanyak 1000 ml, kemudian didiamkan selama 2 hari dan dienap tuangkan. Maserat diuapkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 40 o C dan di freeze dryer sampai diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979. Ekstrak kental yang diperoleh sebanyak 89,6 g. Universitas Sumatera Utara 3.7 Pembuatan Media Untuk Bakteri Uji 3.7.1 Nutrient agar