Rancangan Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Definisi Operasional Etika Penggunaan Hewan Penelitian Analisis Data dan Pengujian Hipotesis

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang dirancang mengikuti Rancangan Acak Lengkap RAL. Jumlah hewan uji perkelompok ditentukan dengan rumus t-1 n-1 ≥15. Jika t adalah jumlah perlakuan dalam penelitian ini ada 4 kelompok perlakuan dan n adalah jumlah ulangan perkelompok, maka jumlah n yang diharapkan teoritis adalah 6 Federer, 1963.

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FMIPA, Universitas Sumatera Utara USU, Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran FK USU, Laboratorium Klinik Pramita, dan Laboratorium Lingkungan, Badan Lingkungan Hidup BLH Sumatera Utara. Penelitian dilakukan selama 5 minggu, dari bulan Agustus sampai September 2010.

3.3. Bahan dan Alat Penelitian

3.3.1. Bahan Penelitian Hewan Percobaan. Hewan percobaan yang akan digunakan dalam penelitian ini

adalah mencit betina Mus musculus L. strain DD Webster berumur ± 8-12 minggu Universitas Sumatera Utara dengan berat badan 25-35 gram yang diperoleh dari FMIPA Biologi USU Medan. Jumlah keseluruhan hewan percobaan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah 24 ekor. Bahan Kimia. Bahan- bahan kimia yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah kalsium sitrat, asam nitrit, aquades,aquabidestilata, dll. Reagensia : Ethanolamine, 8-Hydroxyquinoline, dan Cresolphthalein complexone.

3.3.2. Alat Penelitian

Alat utama yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah : spektrofotometer, tungku muffle furnace, photometer olympus AU 400, spuit 1 ml, stirer, magnet, neraca analitik, timbangan merk Sartorius, gelas ukur, labu ukur 10 ml, cup sampel, jarum gavage, mikropipet 1000 uL, mikropipet 50 uL, rak kalibrator, tabung kalibrasi, scalpel, needle holder, pinset, bak bedah, dll.

3.4. Variabel Penelitian

3.4.1. Variabel Dependent

ƒ Kandungan kalsium dalam darah ƒ Kadar kalsium dalam mandibula ƒ Kadar kalsium dalam tibia 3.4.2. Variabel Independent ƒ Latihan fisik moderat ƒ Suplemen kalsium Universitas Sumatera Utara

3.5. Definisi Operasional

ƒ Kandungan kalsium dalam darah : jumlah kalsium dalam darah mgdl ƒ Kadar kalsium dalam mandibula : jumlah kalsium dalam mandibula ppb ƒ Kadar kalsium dalam tulang tibia : jumlah kalsium dalam tibia ppb ƒ Latihan fisik moderat : latihan fisik yang dilakukan dengan intensitas sedang waktu yang digunakan untuk latihan fisik adalah 70 dari maksimal, yaitu 30 menit. Pada penelitian ini latihan fisik yang dilakukan adalah dengan melakukan aktifitas berenang. ƒ Suplemen kalsium : kalsium yang diberikan kepada mencit dalam bentuk teknis buatan pabrik. Pada penelitian ini suplemen kalsium yang digunakan yaitu, : kalsium sitrat.

3.6. Etika Penggunaan Hewan Penelitian

Penggunaan dan penanganan hewan penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan penelitian yang diatur dalam Deklarasi Helsinki untuk memperoleh ethical clearance dari Komite Etik Penelitian Hewan dari FMIPA Universitas Sumatera Utara Medan. Universitas Sumatera Utara 3.7. Pelaksanaan Penelitian 3.7.1. Pemeliharaan Hewan Percobaan Mencit ditempatkan di dalam kandang berukuran 30x20x10 cm yang terbuat dari bahan plastik yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap empat hari. Cahaya ruangan diatur selama 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00, sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan pellet komersial dan minum air leding PAM diberikan ad libitum setiap hari.

3.7.2. Cara Pembuatan Suplemen Kalsium

Tablet kalsium sitrat yang digunakan adalah tablet kalsium sitrat merk Supracal yang dikelurkan oleh Natures only CA, USA. Tiap tablet kalsium sitrat mengandung 1000 mg kalsium sitrat, Vitamin D3 200IU, 100 mg, Mg 100 mg, dan Zinc 4 mg. Tablet kalsium sitrat 1 tablet digerus dalam cawan penggerus sampai dengan halus, ditimbang dengan neraca analitik sebesar 39,9 mg untuk 1 kandang mencit, kemudian dimasukkan ke dalam botol kecil dan dilarutkan dalam 4,5 ml aquades. Aquades diambil dengan menggunakan mikropipet, kemudian masukkan magnet kecil kedalam botol dan tutup botol dengan ketat. Bubuk kalsium dan aquades diaduk selama ± 15 menit dengan menggunakan magnet stirer sampai menjadi larutan kalsium yang homogen. Setelah larutan kalsium homogen, magnet kecil dikeluarkan dan botol ditutup rapat kembali. Universitas Sumatera Utara Pembuatan larutan kalsium dalam aquadest dilakukan setiap 2 hari di Laboratorium Terpadu FK USU. Bubuk kalsium yang telah digerus ditimbang 39,9 mg kemudian dibungkus dengan kertas perkamen dan disimpan dalam wadah kering untuk kemudian siap digunakan pada pembuatan larutan kalsium dua hari berikutnya.

3.7.3. Perhitungan Dosis Suplemen Kalsium

Dosis pemberian suplemen kalsium sitrat sebesar 27 mg200g BB tikusharioral mengikuti penelitian Yuliati et al 2007. Penetapan dosis kalsium sitrat untuk satu mencit berdasarkan konversi dosis dalam tabel konversi dosis Harmita, 2008. Angka konversi dari tikus dengan berat badan 200g ke mencit dengan berat badan 20g yaitu sebesar 0,14g. Selengkapnya perhitungan dosis suplemen kalsium adalah : Pada tikus : 27 mg200 g BB = setiap 200gBB tikus memperoleh 27 mg kalsium. Pada mencit : 27 mg × 0,14 = 3,78 mg 20g BB mencit = setiap 20g BB mencit harus mendapat 3,78 mg kalsium. Tiap g BB mencit harus mendapat kalsium sebesar 3,78 : 20 = 0,19 mg. Pada penelitian ini rata-rata BB mencit pada P3 dan P4 adalah 35g, sehingga dosisinya: 0,19 mg× 35 g = 6,65 mgekor. Untuk satu kandang 6,65 mg × 6 ekor mencit = 39,9 mg.Cara pemberian kalsium sitrat, dilarutkan dalam 0,5 ml aquades × 9 ekor = 4,5 ml aquades, hal ini berdasarkan volume maksimal larutan yang diberikan pada mencit dengan berat 25-35g per oral adalah sebanyak 1ml Harmita, 2008. Universitas Sumatera Utara

3.7.4. Perlakuan Hewan Percobaan

Jumlah keseluruhan hewan percobaan yang dipergunakan adalah 32 ekor. Perlakuan terdiri atas 4 kelompok, yaitu : a Kelompok I P1 = terdiri dari 6 ekor mencit betina yang tidak diberi perlakuan selama 35 hari. b Kelompok II P2 = terdiri dari 6 ekor mencit betina melakukan latihan fisik berenang selama 30 menit selama 35 hari. c Kelompok III P3 = terdiri dari 6 ekor mencit betina yang diberi suplemen kalsium sitrat 6,65 mgmencitoralhari selama 35 hari. d Kelompok IV P4 = terdiri dari 6 ekor mencit betina melakukan latihan fisik berenang 30 menit dan diberi suplemen kalsium sitrat dengan dosis 6,65 mgmencitoral selama 35 hari. Perlakuan yang diberikan kepada setiap kelompok mencit seperti terlihat pada tabel di bawah ini. Tabel 2. Perlakuan pada Hewan Percobaan Kelompok Perlakuan Air ledeng PAM Latihan fisik moderat Suplemen kalsium mgekororalhari Lamanya Perlakuan hari KI P1 Ad libitum _ _ 35 KII P2 30 menit _ 35 K III P3 _ 6,65mgekororal hari 35 K IV P4 30 menit 6,65mgekororal hari 35 Universitas Sumatera Utara

3.7.5. Prosedur Pelaksanaan Penelitian

Sebelum percobaan, mencit betina ditimbang dan ditempatkan dalam kandang tersendiri di dalam ruangan laboratorium. Mencit dibagi secara acak ke dalam 4 perlakuan, seperti yang ditunjukkan pada gambar 2. P4 Latihan fisik moderat + kalsium 6,65 mg P3 Kalsium 6,65 mg P2 Latihan fisik moderat P1 Tanpa perlakuan kontrol 35 hari Gambar 2. Prosedur pelaksanaan uji pengaruh latihan fisik dan pemberian suplemen kalsium Pada hari ke-36 mencit didekapitasi dan setiap sampel darah dimasukkan dalam spuit 1cc yang telah diberi label, kemudian sampel tulang dimasukkan ke dalam botol-botol plastik. Selanjutnya dibawa ke laboratorium untuk pemeriksaan : kadar kalsium dalam darah, kadar kalsium dalam tulang mandibula, dan kadar kalsium dalam tulang tibia, serta berat tulang mandibula.

3.7.6. Tempat Pelaksanaan Latihan Fisik

Pelaksaanaan latihan fisik berenang terhadap mencit dilaksanakan di Laboratorium Biologi FMIPA USU. Latihan fisik berenang dengan intensitas moderat dilakukan selama 30 menit dengan frekuensi 4x dalam seminggu sehari berenang dan sehari istirahat. Universitas Sumatera Utara Tempat pelaksanaan latihan fisik yaitu pada aquarium plastik yang bening dengan ukuran 50 cm x 35 cm berisi air 30 cm.

3.7.7. Penelitian Pendahuluan

Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mendapatkan patokan sejauh mana mencit dapat melakukan latihan fisik moderat. Latihan fisik moderat adalah latihan fisik yang dilakukan dengan intensitas sedang yaitu 70 dari latihan fisik maksimal. Penelitian pendahuluan dilakukan dengan cara : mencit diberi latihan fisik berenang sampai maksimal yaitu sampai mencit sudah tidak dapat menggerakkan badan lagi dan hampir tenggelam, lalu diangkat dan dikeringkan dengan menggunakan hair dryer. Waktu yang didapat pada latihan fisik maksimal rata-rata 45 menit; jadi untuk pelaksanaan latihan fisik moderat yang akan diterapkan dalam penelitian ini nantinya adalah 70 x 45 menit = 30 menit.

3.7.8. Prosedur Pemberian Suplemen Kalsium

Suplemen kalsium diberikan dengan dosis 6,65 mgmencitperoral. Cara pemberian dengan menggunakan spuit yang ujungnya diganti dengan alat yang tumpul jarum gavage agar tidak menyakiti mencit pada saat pemberian asupan, kalsium tersebut langsung dimasukkan kedalam lambung. Pemberian suplemen kalsium dilakukan pada pagi hari selama 35 hari. Universitas Sumatera Utara

3.7.9. Prosedur Pengambilan Sampel Mandibula dan Tibia

Sampel tulang diambil dengan melakukan pembedahan rahang untuk mengambil mandibula. Rongga mulut dibuka dan mandibula dikeluarkan dengan gunting. Demikian juga, tibia dipisahkan dari fibula dan femur dengan menggunakan gunting. Setelah dikeluarkan, mandibula dan tibia kanan dibersihkan dari jaringan ikat dan lemak dengan menggunakan pisau scalpel. Gigi-geligi mencit disingkirkan atau dicabut dari mandibula dengan menggunakan alat needle holder. Lalu tulang dicelupkan dalam air panas yang mendidih, sehingga sisa-sisa tulang mudah dibersihkan kemudian tulang dibersihkan lagi dengan scalpel. Tulang yang sudah bersih dibungkus dalam kertas aluminium foil dan dimasukkan dalam botol – botol yang telah diberi label sesuai dengan perlakuan masing- masing dan disimpan dalam suhu -20 ⁰C Yang, 2007 dalam KarlinaRI, 2009.

3.8. Prosedur Pengamatan

Setelah 35 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher, yakni diletakkan pada bak bedah dengan keempat anggota gerak terfiksasi dan selanjutnya dibedah untuk pengambilan sampel darah intrakardial menggunakan spuit 1cc yang telah dibilas terlebih dahulu dengan heparin, kemudian diberi label dan disimpan dalam box ice dan segera diantar ke Laboratorium Pramita, Medan untuk penetapan kadar kalsium tulang. Selanjutnya dilakukan pengamatan kandungan kalsium darah, kadar kalsium mandibula, dan kadar kalsium tibia. Universitas Sumatera Utara

3.8.1. Prosedur Pengamatan Kandungan Kalsium dalam Darah

. Pengamatan kadar kalsium dalam darah dilakukan dengan alat Photometer Olympus 400. Darah mencit diambil dari jantung mencit intrakardial dengan menggunakan spuit 1 cc yang sebelumnya telah dibilas dengan heparin, kemudian diputar centrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit untuk diambil plasmanya. Kemudian diperiksa dengan alat fotometer Olympus 400, dengan memakai reagen kalsium. Sebelum melakukan pemeriksaaan kalsium lakukan kalibrasi dan kontrol terlebih dahulu. Kalibrator dan kontrol dilarutkan dengan aquabidestilata 5 ml dan dicampur dengan sampai homogen, dibagi dalam cup 300µl kemudian disimpan dalam freezer. Kalibrator dan kontrol dalam kit disimpan pada suhu 2-8 ºC. Selanjutnya lakukan kalibrasi bersamaan dengan kontrol dan sampel, sbb : - Pipet 1000 µl Blankko Aquabides ke dalam cup serum dan diletakan pada rak Blanko yang telah ditentukan. - Pipet 300 µl Kalibrator kalsium dan kontrol ke dalam cup serum dan letakkan pada rak kalibrator yang telah ditentukan. - Jalankan kalibrator dan kontrol dalam alat fotometer Olympus 400. Jika hasil berada dalam range yang ditentukan, baru sampel dimasukkan dalam alat fotometer. - Sampel dimasukkan dalam Spektrofotometer untuk penetapan kadar kalsium dalam darah. Universitas Sumatera Utara

3.8.2. Pengamatan Kadar Kalsium dalam Mandibula dan Tibia

Analisis kadar ion kalsium dalam mandibula dan tibia dilakukan di Laboratorium Lingkungan BLH Badan Lingkungan Hidup Medan, dengan menggunakan alat AAS Atomic Absorbantion Spectrophotometry dengan merk Perkin Elmer 3110. Tulang dikeluarkan dari lemari pendingin dan dibiarkan hingga kondisisnya mencapai kira-kira suhu ruang. Kemudian tulang dimasukkan kedalam cawan porselen dan diberi label sesuai dengan perlakuannya dan dimasukkan kedalam oven dengan suhu 95⁰C selama 24 jam. Tulang diabukandimineralisasi dalam tungkutanur muffle furnace pada suhu 600 ⁰C metode kering selama 25 jam atau dalam 5 hari pengerjaan. Setelah tulang menjadi abu, cawan porselen dikeluarkan kemudian ditambahkan 2 ml asam nitrit HNO 3 65, kemudian abu tulang dicuci dengan aquades dan ditambahkan 2 ml HCl 30 untuk menghilangkan mineral-mineral yang tidak diinginkan, lalu sampel disaring dengan kertas saring hingga larutan sampel menjadi 10 ml. Sampel dimasukkan ke dalam labu ukur yang berukuran10 ml. Penetapan kadar kalsium di ukur menggunakan alat AAS Perkin Elmer 3110, dengan panjang gelombang -422.7nm Rahnama, 2004.

3.9. Analisis Data dan Pengujian Hipotesis

Data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku rata-rata ±SD. Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Data yang diperoleh distribusinya tidak Universitas Sumatera Utara normal dan atau tidak homogen, maka dilakukan transformasi data. Kemudian diuji lagi normalitas dan homogenitas data. Ternyata data masih tidak normal distribusinya atau tidak homogen maka diuji dengan uji Kruskal-Wallis. Untuk melihat perbedaan antar kelompok kontrol dan kelompok perlakuan mengunakan uji Mann Whitney. Semua analisis data dilakukan dengan menggunakan SPSS 18,0. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata- rata pada p ≤ 0,05 yang dianggap signifikan.

3.10. Jadwal Penelitian