perlakuan terdiri dari 5 ekor mencit jantan. Penentuan jumlah ulangan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL untuk setiap perlakuan ditentukan
berdasarkan rumus frederer Chairul et al., 1992 yaitu: t-1 n-1
≥ 15 dimana : t adalah jumlah perlakuan
n adalah jumlah ulangan
Tabel 3.1 Kelompok perlakuan Perlakuan Castrol Oil MSG Vitamin C Vitamin E
0,3 ml 4 mggBB 0,26 mggBB 0,026 mggBB K- - - - -
K+
√ - - - P1 -
√ - - P2 -
√ √ - P3
√ √ - √ P4
√ √ √ √
Keterangan:
√ = Diberikan - =
Tidak diberikan BB = Berat badan
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Hewan Percobaan
Hewan uji yang digunakan Mus musculus L. jantan yang berusia 8-12 minggu
dengan berat badan rata-rata 25 g. Dibagi dalam perlakuan dan kontrol. Mencit diberi makan dan minum secara ad-libitum. Kandang mencit dijaga kebersihannya dan diberi
sirkulasi udara yang baik. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Perlakuan terhadap hewan coba berpedoman pada prinsip-
prinsip penelitian kesehatan yang menggunakan hewan secara etis, prosedur dan standar yang dibuktikan dengan Ethical Clearance dan Komite Etik Penelitian Hewan,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Pembuatan Bahan Uji
Dosis pemberian MSG adalah 4 mgg BB mencit Simanjuntak, 2010. Untuk mencit yang beratnya 25 g, dosis yang digunakan adalah 100 mgekor. Pembuatan
larutan MSG dilakukan dengan melarutkan serbuk MSG sebanyak 100 mg ke dalam 0,2 ml aquadest. Dosis pemberian vitamin C adalah 0,26 mgg BB Simanjuntak,
2010. Untuk mencit yang beratnya 25 g, dosis yang digunakan adalah 6,5 mgekor. Pembuatan larutan vitamin C dilakukan dengan melarutkan serbuk vitamin C
sebanyak 6,5 mg ke dalam 0,2 ml aquadest. Dosis pemberian vitamin E sebanyak 0,026 mgg BB Anggraini, 2006. Untuk mencit yang beratnya 25 g, dosis yang
digunakan adalah 0,65 mgekor. Pembuatan larutan vitamin E dilakukan dengan cara melarutkan vitamin E sebanyak 0,026 mg ke dalam 0,3 ml castrol oil.
3.4.3 Pembuatan Preparat Testis Mencit Jantan dengan Metode Parafin
Pembuatan sediaan histologis testis mencit dimulai dengan membunuh mencit secara dislokasi leher. Selanjutnya mencit dibedah, diambil organ testis dan dicuci dengan
larutan NaCl 0,9, lalu difiksasi dengan menggunakan larutan bouin selama 1 malam. Setelah organ testis difiksasi, dilakukan pencucian washing dengan menggunakan
alkohol 70 yang bertujuan untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan. Selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan cara merendam organ testis berturut-
turut ke dalam alkohol 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96, dan alkohol absolut. Botol yang berisi testis tersebut digoyang-goyangkan terus menerus shaker
dengan menggunakan tangan agar proses dehidrasinya lebih cepat. Lalu dilakukan penjernihan clearing dengan cara merendam organ testis ke dalam xylol murni
selama 1 malam.
Tahap selanjutnya adalah infiltrasi dengan cara merendam organ testis berturut-turut ke dalam xylol:parafin dengan perbandingan 3:1, 1:1, 1:3 dan berakhir
di parafin murni masing-masing selama 1 jam. Proses infiltrasi ini dilakukan di dalam oven dengan suhu 56
o
C. Selanjutnya dilakukan proses penanaman organ dalam prafin, sebelum melangkah ke proses ini yang harus disiapkan adalah mencairkan parafin,
Universitas Sumatera Utara
membuat kotak-kotak dari karton atau kalender bekas untuk tempat penanaman, menyiapkan lampu spiritus, menyediakan pinset kecil, dan menyediakan label.
Setelah semuanya telah siap, proses penanaman organ embedding dimulai dengan menuangkan parafin cair kedalam kotak-kotak karton, selanjutnya ambil organ testis
dengan cepat dari parafin murni dengan menggunakan pinset kecil lalu dimasukkan ke dalam kotak yang telah berisi parafin cair tadi, biarkan hingga parafin menjadi keras
sampai terbentuk blok-blok parafin.
Pada tahap selanjutnya, dilakukan pemotongan blok parafin yang telah ditempelkan pada holder kemudian dipasang pada mikrotom, lalu mikrotom diputar
sampai blok parafin yang berisi organ tadi terpotong menjadi pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6 µm.
Hasil pemotongan yang berbentuk pita diletakkan
pada objek glass, lalu dicelupkan ke dalam air dingin air biasa kemudian ke dalam air panas.
Lalu diletakkan di atas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin ke objek glass.
Sediaan dimasukkan ke dalam xylol
selama ± 15 menit
untuk deparafinisasi, selanjutnya sediaan didealkoholisasi. Proses dealkoholisasi dimulai dari
alkohol absolut, alkohol 96, alkohol 90, alkohol 80, alkohol 70, alkohol 60, alkohol 50 dan
alkohol 30
. Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Tahap selanjutnya adalah
pewarnaan. Objek glass yang telah berisi irisan jaringan tadi dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama 3-7
menit, dicuci dengan air mengalir ± 10 menit, dimasukkan ke dalam alkohol 30, 50, dimasukkan ke dalam larutan pewarna Eosin 0,5 dalam alkohol 70 selama 1-
3 menit, preparat dimasukkkan berturut-turut ke dalam alkohol 60, 70, 80, 90, 96, dan alkohol absolut, dikeringkan dengan kertas pengisap. Selanjutnya, preparat
dimasukkan ke xylol. Sediaan ditetesi dengan Canada balsam kemudian ditutup dengan cover glass. Setelah itu diberi label dan diamati di bawah mikroskop.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Parameter Pengamatan 3.4.4.1 Berat Testis
Penentuan berat testis dilakukan dengan cara menimbang testis bagian kiri dan kanan mencit dengan timbangan digital yang mempunyai akurasi 0,01 g. Berat kedua
testis dirata-ratakan dan menjadi berat rata-rata testis masing-masing mencit.
3.4.4.2 Volume Testis
Untuk menentukan volume testis, diukur panjang dan lebar testis dengan menggunakan kertas milimeter. Volume testis dihitung mengikuti Sheti dan
Chaturvedi 1991 dengan menggunakan rumus:
4 TV =
ח.a.b²
3 Keterangan:
TV
= Volume testis cm³ a
= Panjang testis b
= Lebar testis ח
= 3,14
3.4.4.3 Diameter Tubulus Seminiferus
Pengukuran dilakukan pada tubulus seminiferus yang berbentuk bulat, atau mendekati bulat. Dilakukan pengamatan untuk masing-masing potongan testis.
Pengukuran diameter tubulus seminiferus dengan menggunakan
mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 dan beserta program komputer Axiovision 4.0
. Diameter tubulus seminiferus diukur secara menyilang dari sisi yang berseberangan dan dirata-ratakan,
masing-masing tiga kali ulangan.
Pengukuran tersebut dilakukan pada masing-masing preparat testis kanan dan kiri.
Amir, 1992.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4.4 Jumlah Sel Spermatogenik
Perhitungan dilakukan terhadap jumlah sel
pada setiap tahapan spermatogenesis spermatogonium, spermatosit primer, dan spermatid pada tubulus
seminiferus testis. Penghitungan sel spermatogenik dilakukan dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40 x 10 beserta program komputer
Axiovision 4.0
. Penghitungan jumlah sel spermatogenik dilakukan
pada masing-masing preparat testis kanan dan kiri
Amir, 1992.
3.5 Analisis Statistik
