38
3.4.4 Uji Anti Radikal Bebas DPPH Kubo et al, 2002
Buffer asetat 100 mM pH 5,5 sebanyak 1,5 ml ditempatkan pada tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2,805 ml etanol PA, 0,15 ml DPPH 10 mM dalam
metanol dan 0,045 ml ekstrak serealia yang digunakan untuk pengujian kadar fenol total. Campuran di vorteks dan disimpan pada ruang gelap dengan suhu
kamar selama 20 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Sebagai standar digunakan asam askorbat dengan konsentrasi 0, 6.25, 12.5, 25, 50
dan 100 mgml. Aktivitas penangkapan radikal bebas dihitung sebagai persentase berkurangnya warna DPPH dengan menggunakan persamaan :
Abs kontrol – Abs sampel
Aktivitas antioksidan = Absorbansi kontrol
Dibuat kurva standar asam askorbat dengan perbandingan antara kapasitas antioksidan dan konsentrasi asam askorbat ppm. Antioksidan pada ekstrak
serealia dinyatakan dalam mg vitamin C eqivaleng biji. Nilai tersebut menunjukkan kesetaraan aktivitas antioksidan 1 gram serealia dengan 1 mg
vitamin C. Kurva standar pengukuran aktivitas antioksidan dengan standar vitamin C dapat dilihat pada Lampiran 2.
3.4.5 Uji Organoleptik Adawiyah et al, 2007
Sebelum dilakukan uji organoleptik, serealia yang telah disosoh dimasak secara konvensional hingga menjadi bubur siap konsumsi. Waktu pemasakan
untuk sorgum adalah 40 dan 45 menit dengan perbandingan air 1:10 dan 1:11 grml. Untuk jewawut, waktu pemasakan adalah 20 dan 25 menit dengan
perbandingan air 1:7 dan 1:8 grml. Sedangkan untuk ketan hitam waktu pemasakan adalah 25 dan 30 menit dengan perbandingan air 1:7 dan 1:8 grml.
Pada uji organoleptik panelis membandingkan bubur serealia dengan bubur oatmeal yang dikenal oleh masyarakat. Uji organoleptik dilakukan dengan uji
deskripsi untuk mengidentifikasi karakteristik sensori yang penting pada serealia. Uji organoleptik dilakukan dengan 20 orang panelis. Parameter organoleptik yang
diujikan adalah rasa, warna, aroma dan tekstur. Pada uji organoleptik bubur serealia akan dibandingkan dengan bubur oatmeal, untuk melihat perbedaan
karakteristik sensori dari bubur serealia dengan produk bubur oatmeal yang telah dikenal masyarakat. Untuk lebih jelasnya kuesioner penilaian dan lembar kerja
untuk uji organoleptik disajikan pada Lampiran 3 dan 4.
39
3.5 Uji Proliferasi Sel Limfosit Manusia Secara In Vitro
3.5.1 Pembuatan Ekstrak Serealia untuk Uji Proliferasi Sel Limfosit
Manusia a.
Ekstraksi dengan Pelarut Air Bebas Ion
Sampel halus serealia sebanyak 10 gram ditempatkan dalam botol sentrifuse, selanjutnya ditambahkan 100 ml air bebas ion. Sampel di shaker
dengan kecepatan 35 rpm selama 24 jam pada suhu kamar. Larutan kemudian disentrifuse selama 30 menit pada kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang
diperoleh ditampung di erlenmeyer. Residu sampel selanjutnya dicuci sebanyak 2 kali dengan cara menambahkan air bebas ion, selanjutnya di shaker selama
1 jam dan disentrifuse kembali selama 30 menit pada 3000 rpm. Tiga supernatan yang diperoleh ditampung pada erlenmeyer kemudian disaring
dengan kertas Whatman no. 4 dengan bantuan pompa vakum. Larutan selanjutnya dikeringkan dengan freeze dryer pada suhu -75
C. Ekstrak kering hasil freeze dryer yang didapat selanjutnya dibuat sebagai larutan stok uji
dengan konsentrasi 200 mgml pelarut. Contoh pembuatan larutan stok ekstrak serealia dapat dilihat pada Lampiran 5.
b. Ekstraksi dengan Pelarut Aseton Awika et al, 2003
Sampel halus serealia sebanyak 10 gram ditempatkan dalam botol sentrifuse, selanjutnya ditambahkan 100 ml aseton 70. Sampel di shaker
dengan kecepatan 35 rpm selama 2 jam pada suhu kamar, kemudian disimpan pada suhu -20
o
C ditempat gelap selama 24 jam. Setelah 24 jam larutan di equilibrium selama 1 jam pada suhu ruang. Larutan selanjutnya disentrifuse
selama 30 menit pada 3000 rpm. Residu sampel selanjutnya dicuci sebanyak 2 kali dengan cara menambahkan aseton 70, selanjutnya di shaker selama 1
jam dan disentrifuse kembali selama 30 menit pada 3000 rpm. Tiga supernatan yang diperoleh ditampung pada erlenmeyer, disaring dengan kertas Whatman
no. 4 dengan bantuan pompa vakum, kemudian di keringkan dengan rotary evaporator pada suhu 40
C untuk menguapkan aseton. Larutan sisa pengeringan dengan rotary evaporator selanjutnya dikeringkan kembali dengan
menggunakan freeze dryer pada suhu -75 C. Ekstrak kering hasil freeze dryer
yang didapat selanjutnya dibuat sebagai larutan stok uji konsentrasi 200 mgml pelarut.
40
Ekstrak masing-masing serealia dengan konsentrasi 200 mgml selanjutnya dibuat menjadi konsentrasi larutan kerja ekstrak serealia seperti
yang terdapat pada Tabel 8.
Tabel 8. Konsentrasi larutan kerja ekstrak serealia untuk uji proliferasi sel limfosit
Jenis Serealia Konsentrasi Larutan Kerja Ekstrak Serealia
mg ekstrakml pelarut Aquadest
Aseton
Sorgum 3,50
2,61 Jewawut
3,83 2,64
Ketan Hitam 5,33
4,62
Larutan kerja ekstrak serealia dengan konsentrasi seperti pada Tabel 8 tersebut dibuat sebanyak 1 ml. Pembuatan larutan kerja ekstrak serealia
dilakukan dengan cara mengambil ekstrak serealia konsentrasi 200 mgml dengan jumlah yang ditunjukkan pada Tabel 9.
Tabel 9. Jumlah ekstrak serealia konsentrasi 200 mgml yang diambil untuk membuat larutan kerja ekstrak serealia
Jenis Serealia Jumlah Ekstrak Serealia Konsentrasi 200 mgml
yang diambil untuk membuat larutan kerja µl Aquadest
Aseton
Sorgum 17
13 Jewawut
19 13
Ketan Hitam 27
23
Ekstrak serealia konsentrasi 200 mgml yang diambil tersebut Tabel 9 selanjutnya ditepatkan dengan masing-masing pelarut yang digunakan untuk
proses ekstraksi yaitu aseton 70 dan air bebas ion hingga 1 ml dalam tabung ependorf sehingga didapat ekstrak serealia dengan konsentrasi seperti yang
ditunjukkan pada Tabel 8. Konsentrasi ekstrak pada Tabel 8 adalah konsentrasi larutan kerja ekstrak serealia yang ditambahkan ke sumur kultur pada uji
proliferasi sel limfosit manusia, dimana jumlah ekstrak yang ditambahkan adalah sebanyak 20 µl. Sebelum ditambahkan ke sumur kultur, ekstrak
disterilisasi terlebih dahulu dengan penyaring membran 0,22 μm.