21
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan dan penyiapan bahan, karakterisasi simplisia, skrining
fitokimia, pembuatan ekstrak, penyiapan hewan percobaan dan pengujian pen- garuh kombinasi ekstrak etanol kulit kayu manis dan madu terhadap penurunan
kadar glukosa darah pada tikus jantan.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari: lemari pengering, blender Phi- lip, oven Memmert, neraca listrik Mettler Toledo, neraca hewan GW-
1500, rotary evaporator Heidolph WB 2000, glukometer EasyTouch
®
GCU dan strip glukotest EasyTouch
®
GCU strip test, spuit, oral sonde, mor- tir dan stamfer, alat-alat gelas lainnya, dan kertas filter.
3.2 Bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit kayu manis Cinnamomum burmannii Nees T.Nees Blume dan madu. Bahan
kimia yang digunakan adalah etanol 96 destilasi, pereaksi bouchardat, Dra- gendorff, Mayer, besi III klorida 4,5 bv, Molish, timbal II asetat 0,4 M,
asam sulfat 6 N, asam klorida 2 N, metanol, kloroform-isopropanol, Lieber-
Universitas Sumatera Utara
22 man-Burchard, toluen, kloroform, glukosa 50, Na-CMC natrium carboxy
methyl cellulose, glibenklamid dan akuades.
3.3 Prosedur Pembuatan Simplisia 3.3.1 Pengambilan bahan
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel kulit kayu manis diambil
dari Tiga Dolok Kecamatan Dolok Panribuan Kabupaten Simalungun, Sumatera Utara dan Sampel madu diambil dari PTP V Sei Rokan Kecamatan
Kunto Darussalam Kabupaten Rokan Hulu, Riau.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi sampel kulit kayu manis dilakukan di Herbarium Bogo- riense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor.
3.3.3 Pembuatan simplisia
Bahan baku kulit kayu manis dikumpulkan, dicuci bersih di bawah air mengalir, ditiriskan, dan ditimbang beratnya 2,276 kg. Kulit kayu manis se-
lanjutnya dikeringkan di lemari pengering hingga kering, dibuang benda asing yang masih tertinggal pada simplisia, kemudian ditimbang beratnya 1,714 kg
dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air, peneta-
Universitas Sumatera Utara
23 pan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan ka-
dar abu tidak larut dalam asam.
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik dan organoleptik
Pemeriksaan makroskopik dan organolepik dilakukan dengan menga- mati bentuk, bau dan rasa dari kayu manis, serbuk simplisia kulit kayu manis
dan simplisia madu.
3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia kulit kayu manis dan simplisia madu. Serbuk simplisia kulit kayu manis diletakkan
di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop. Simplisia
madu diletakkan di atas kaca objek lalu ditetesi dengan aquadest dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
3.4.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi to- luena. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung,
tabung penerima 5 mL berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja:
Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bu- lat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin se-
lama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia
yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Se-
Universitas Sumatera Utara
24 telah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik
sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin
dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memi-
sah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua vo- lume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan
yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Depkes RI, 1977.
3.4.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai
kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa di- panaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI,
1977.
3.4.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam per-
tama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering
dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Si-
Universitas Sumatera Utara
25 sa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
Depkes RI, 1977. 3.4.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sam-
pai arang habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air pa- nas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring da-
lam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikering-
kan Depkes RI, 1977. 3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikum-
pulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipi- jarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu
yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1977.
3.5 Skrining Fitokimia Simplisia
Skrining fitokimia serbuk simplisia kulit kayu manis dan simplisia madu meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, alkaloid, saponin,
tanin, glikosida dan steroidtriterpenoid.
Universitas Sumatera Utara
26
3.5.1 Pemeriksaan flavanoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 10 ml air panas, dididih- kan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi
warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.5.2 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alka- loid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada
masing-masing tabung reaksi: a.
Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b.
Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c.
Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga perco-
baan diatas Depkes RI, 1977.
3.5.3 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian diko-
cok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang sta-
Universitas Sumatera Utara
27 bil tidak kurang dari 10 menit dan buih tidak hilang dengan penambahan 1
tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1977.
3.5.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu dis- aring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2
ml larutan dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin
Depkes RI, 1977.
3.5.5 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96-air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2
jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit,
lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloroform-isopropanol 3:2 sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari lapisan isopropanol diuapkan pada suhu
tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol untuk larutan percobaan. 0,1 ml larutan percobaan diuapkan diatas penangas air, pada sisa
ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan
adanya ikatan gula Depkes RI, 1977.
3.5.6 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml nheksan selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan
Universitas Sumatera Utara
28 pada sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard melalui dinding ca-
wan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru un- gu atau biru hijau menunjukkan adanya triterpenoidsteroid Harborne, 1987.
3.6 Proses Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Kayu Manis EEKM Metode: Maserasi
Cara Kerja: Masukkan 10 bagian 500 g simplisia atau campuran simplisia dengan derajat halus yang cocok dalam bejana, dituangi dengan 75 bagian cai-
ran penyari etanol 96 3,75 liter, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlin- dung dari cahaya sambil sering diaduk, lalu diserkai, diperas, di remaserasi
ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian 5 liter, maserat dipindahkan kedalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat yang sejuk,
terlindung dari cahaya selama 2 hari, lalu di enaptuangkan atau disaring. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Kemudian
dikeringkan dengan freeze dryer selama lebih kurang 24 jam Ditjen POM, 1979.
3.7 Pemeriksaan Karakteristik EEKKM
Pemeriksaan karakteristik ekstrak etanol kulit kayu manis meliputi, pe- netapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari
larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam. Prosedur pemeriksaan karakterisasi ekstrak etanol kulit kayu
manis sama seperti prosedur karakterisasi simplisia kulit kayu manis.
Universitas Sumatera Utara
29
3.8 Skrining Fitokimia EEKM
Kategori