d. Preparasi Spesimen Kolon Untuk Analisis SEM Scanning Electron
Microscope modifikasi Savage Blumershine 1974
Satu ekor tikus tiap kelompok dibedah dan diambil bagian kolonnya. Kolon dibersihkan dari isinya dengan cara diambil
menggunakan sudip steril kemudian kolon dipotong pendek sekitar 0.5 cm. Selanjutnya potongan kolon tersebut direndam dalam larutan 2
glutaraldehyde dalam buffer phosphate pada pH 7.3 dan suhu 4
o
C yang kemudian disimpan selama 2 hari tahap prefiksasi. Tahap ini
bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah struktur sel yang akan diamati. Pada tahap fiksasi, sampel direndam dalam tannic acid 2
selama 6 jam, selanjutnya dicuci dengan cacodylate buffer selama 15 menit sebanyak 4 kali, kemudian dicuci dengan osmium tetraoksida 1
selama 1-4 jam dan dicuci dengan akuades selama 15 menit sebanyak 1 kali. Tahap ini terutama bertujuan untuk memberikan kontras yang
lebih baik sehingga lebih mudah untuk diamati. Pada tahap dehidrasi, sampel direndam dengan alkohol konsentrasi bertingkat, yaitu 50
selama 5 menit sebanyak 4 kali, 70 selama 20 menit, 85 selama 20 menit, 95 selama 20 menit, dan alkohol absolut selama 10 menit
sebanyak 2 kali. Tahap dehidrasi ini bertujuan untuk menurunkan kadar air dalam sayatan sehingga tidak mengganggu proses pengamatan.
Spesimen kemudian dibekukan dalam freezer sampai beku, selanjutnya dimasukkan freeze dryer sampai kering. Spesimen selanjutnya
direkatkan pada stub menggunakan perekat karbon, disepuh dengan emas metal coating. Pelapisan dengan emas ini bertujuan untuk
mempertinggi kontras terhadap sel. Sampel siap diamati dengan SEM.
e. Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Hadioetomo 1993
Sebanyak 1 lup penuh air steril diletakkan pada kaca obyek, kemudian dengan jarum ose steril dipindahkan sedikit isolat ke atasnya,
selanjutnya dicampurkan dan disebarkan hingga rata dan dibiarkan olesan mengering oleh udara. Kaca obyek dilalukan di atas api Bunsen,
di mana kaca obyek harus terasa agak panas bila ditempelkan pada
punggung tangan, atau sekali-kali dikering anginkan di udara hingga terbentuk lapisan kultur yang tipis dan merata.
Pewarnaan Gram dimulai dengan meneteskan pewarna primer kristal violet secara merata di atas kultur pada kaca obyek, dan
dibiarkan selama 1 menit. Kemudian kaca obyek dimiringkan untuk membuang kelebihan kristal violet, lalu dibilas dengan air dari botol
pijit, dan sisa air diserap dengan menggunakan kertas serap. Olesan ditetesi dengan lugol selama 2 menit, kemudian dimiringkan seperti di
atas dan kemudian dibilas dengan air, sisa warna yang masih ada dihilangkan dengan pemucat warna etanol 95, tetes demi tetes selama
10-20 detik sampai zat warna kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca obyek. Selanjutnya dicuci kembali dengan air dari botol pijit, lalu
ditiriskan dan ditetesi dengan larutan safranin selama 10-20 detik. Kaca obyek kemudian dimiringkan dan kembali dibilas dengan air dari botol
pijit, ditiriskan dan sisa air yang masih ada diserap dengan kertas serap. Preparat siap untuk diperiksa dengan mikroskop.
Pemeriksaan dengan
mikroskop dilakukan
dengan menggunakan lensa obyektif minyak imersi 1000x, dimulai dari
perbesaran yang terendah dan berangsur-angsur diganti dengan yang tinggi. Pengamatan dilakukan terhadap ukuran, bentuk, cara
pengelompokan tunggal, berpasangan, rantai, bergerombol, dan sebagainya. Reaksi Gram positif ditandai dengan warna sel ungu atau
biru dan Gram negatif berwarna merah muda.
IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengujian Aktivitas Antibakteri Lactobacillus terhadap E. coli
Kategori