Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Hasil

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian a. Variabel bebas : ekstrak polar daun binahong dengan konsentrasi 100, 75, 50, dan 25 bv. b. Variabel tergantung : diameter zona hambat c. Variabel pengacau terkendali : media pertumbuhan mikroba uji, waktu inkubasi 24 jam, suhu inkubasi 37ºC, kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mc. Farland II 6x 10 8 CFUml, umur tanaman, tempat tumbuh, diameter paper disk 6 mm, jenis bakteri uji, volume suspensi bakteri uji yang diinokulasikan dalam media 0,2 ml, volume larutan uji yang diinokulasikan dalam paper disk 20µl d. Variabel tak terkendali : suhu pengeringan bahan dengan sinar matahari

2. Definisi Operasional

a. Potensi antibakteri adalah kemampuan ekstrak polar daun binahong yang dapat menghambat atau membunuh bakteri uji B. subtilis dan P. Aeruginosa yang dapat dilihat dari zona jernih yang menggambarkan zona hambat pertumbuhan bakteri, dibandingkan dengan CMC 1 sebagai pelarut. b. Ekstrak polar daun binahong adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi 150 g serbuk daun binahong secara maserasi dengan pelarut kloroform, ampas hasil penyarian diangin-anginkan, kemudian ampas dimaserasi lagi dengan etanol etanol 70 sebanyak 3500 ml dan menghasilkan ekstrak kental sebanyak 22,24 g. c. Metode difusi paper disk merupakan metode difusi dengan menggunakan paper disk yang diletakkan pada media yang telah ditanami bakteri. Ke dalam paper disk diberi larutan uji dan diinkubasi pada suhu 37º C selama 24 jam. d. Zona hambat adalah zona jernih yang tidak dijumpai pertumbuhan bakteri uji B. subtilis dan P. aeruginosa dan zona yang masih terdapat bakteri uji B. subtilis dan P. aeruginosa dalam jumlah yang sedikit. e. Daun binahong diambil dari tanaman binahong yang diperoleh dari kebun obat Balai Penelitian Tanaman Obat BPTO Tawangmangu. f. Kultur murni Bacillus subtilis ATCC 6633 merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang silinder, berdiameter 1µm dengan panjang 3-4 µm, lurus atau sedikit lengkung dengan ujung bulat, tunggal atau rantai dan diperoleh dari Dinas Kesehatan Propinsi D.I Yogyakarta. g. Kultur murni Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 merupakan bakteri batang Gram-negatif, bergerak, aerob, berukuran sekitar 0,6 x 2 µm dan terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan diperoleh dari Dinas Kesehatan Propinsi D.I Yogyakarta.

C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan

a. Daun tanaman binahong yang berupa simplisia kering diperoleh dari kebun obat Balai Penelitian Tanaman Obat BPTO Tawangmangu. b. Kultur murni B. subtilis ATCC 6633 merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang dan diperoleh dari Dinas Kesehatan Propinsi D.I Yogyakarta. c. Kultur murni P. aeruginosa ATCC 27853 merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang dan diperoleh dari Dinas Kesehatan Propinsi D.I Yogyakarta. d. Medium Nutrient Agar NA, larutan Mc. Farland II 6x 10 8 CFUml, paper disk , amoksisilin injeksi kering Danoxilin® 1000 mg, CMC 1, aquadest steril, Silika gel GF 254 E. Merck, toluen, etil asetat, metanol, air, butanol, asam asetat glasial, pereaksi semprot Dragendorff, pereaksi semprot FeCl 3 , uap amonia, skopolamin, eugenol, rutin, asam tanat.

2. Alat

Maserator, Beaker glass, cawan petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, flakon, pipet volume Pyrex, jarum ose, spreader, mikropipet Ependrof-Netler-Hinz, autoklaf Model KT-40, ALP Co, Ltd, Hamurashi Tokyo, Japan, inkubator Memmert, type BE 400, GmbH + CoKG- D91126, Swahaban FRG, Germany, plat KLT, neraca analitik Nagata, lampu UV, penyerbuk Retsch bv, oven Memmert, Germany, rotary evaporator Janke Kunkel, Ika- labotechnik, RVO5-ST. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

D. Tata Cara Penelitian

1. Identifikasi tanaman Identifikasi tanaman binahong dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat BPTO Tawangmangu.

2. Pengumpulan bahan dan pengeringan

Daun binahong yang diperoleh dari kebun Balai Penelitian Tanaman Obat BPTO Tawangmangu berupa simplisia kering.

3. Pembuatan serbuk

Pembuatan serbuk dilakukan dengan menggunakan blender kering sampai diperoleh serbuk halus. Kemudian dilakukan pengayakan dengan menggunakan pengayak berukuran 1250 sampai semua serbuk dapat melewati ayakan.

4. Uji tabung

a. Uji pendahuluan Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dengan 10 ml air selama 30 menit di atas air mendidih. Larutan yang diperoleh disaring melalui kapas. Jika larutan menjadi berwarna kuning sampai merah dan bila pada saat penambahan kalium hidroksida warna larutan menjadi lebih intensif berarti menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor dengan gugus hidrofilik.

b. Uji alkaloid

Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dalam tabung reaksi dengan 10 ml asam klorida 1 selama 30 menit. Suspensi disaring dengan kapas ke dalam tabung reaksi A dan B sama banyak, larutan A dibagi dua sama banyak, lalu ke dalam larutan A1 ditambah 3 tetes pereaksi Dragendroff dan larutan A2 ditambah 3 tetes pereaksi Mayer. Bila terbentuk endapan dengan kedua pereaksi alkaloid berarti menunjukkan adanya alkaloid. Adanya alkaloid dari basa tertier dan kuartener ditunjukkan dengan penambahan serbuk natrium karbonat sampai pH 8-9, dicampur dengan 4 ml kloroform dan diaduk pelan. Setelah kloroform memisah, diambil dengan pipet Pasteur, ditambahkan asam cuka 5 hingga pH 5. diaduk lalu dipisahkan lapisan atasnya, tambah 5 tetes pereaksi Dragendroff pada lapisan atas, bila terbentuk endapan menunjukkan alkaloid dari basa kuartener. Lapisan bawah ditambah 10 tetes asam klorida 1 diaduk dan dipisahkan lapisan atas serta ditambah 2 tetes pereaksi Dragendroff. Bila didapatkan endapan berarti menunjukkan alkaloid dari basa tertier.

c. Uji antrakinon

Tiga ratus miligram serbuk daun binahong dididihkan 2 menit dengan 10 ml kalium hidroksida 0,5 N dan 1 ml larutan hidrogen peroksida, setelah dingin suspensi disaring melalui kapas. Lima ml filtrat ditambah 10 tetes asam asetat sampai pH 5, ditambahkan 10 ml toluen. Lima ml lapisan atas dipisahkan dengan dipipet dan dimasukkan dalam tabung reaksi. Ditambah kalium hidroksida 0,5 N, bila didapatkan warna merah pada lapisan air berarti menunjukkan adanya senyawa antrakinon.

d. Uji polifenol

Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dengan 10 ml air selama 10 menit dalam pengangas air mendidih. Disaring panas-panas, setelah dingin ditambah 3 tetes pereaksi besi III klorida. Bila didapatkan warna hijau-biru PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI menunjukkan adanya polifenol. Uji diulang dengan filtrat hasil pendidihan 2 g serbuk dengan 9-10 ml etanol 80 selama 10 menit dalam pengangas air. e. Uji tanin Dua gram serbuk daun binahong dipanaskan dengan 10 ml air selama 30 menit di atas penangas air. Disaring 5 ml filtrat ditambah 1 ml larutan NaCl 2, bila terjadi suspensi atau endapan disaring melalui kertas saring. Filtrat ditambah 5 ml larutan gelatin 1. Bila terbentuk endapan menunjukkan adanya tanin. f. Uji saponin 1 Tambahkan 10 ml air suling ke dalam tabung reaksi yang berisi 100 mg serbuk daun binahong, ditutup dan dikocok kuat-kuat selama 30 detik. Tabung dibiarkan dalam posisi tegak selama 30 menit. Apabila terbentuk buih setinggi kurang lebih 3 cm dari permukaan cairan, menunjukkan adanya saponin. 2 Uji lain dilakukan dengan pipa kapiler diameter 1 mm, panjang 12,5 cm. Larutan hasil pemanasan 2 g serbuk daun binahong dengan 10 ml air dipanaskan selama 30 menit di atas penangas air. Setelah disaring, filtrat dimasukkan ke dalam pipa kapiler penuh-penuh. Kapiler diletakkan dalam posisi tegak, lalu cairan dibiarkan mengalir bebas. Tinggi air suling yang diperlakukan sama. Bila didapatkan tinggi cairan yang diuji setengah atau kurang dari tinggi air suling maka menunjukkan adanya saponin.

5. Pembuatan ekstrak polar daun binahong

Sebanyak 150 g serbuk daun binahong dimaserasi dengan 1125 ml kloroform selama 24 jam dalam Erlenmeyer ditutup alumunium foil dan dilakukan dengan platform shaker. Hasil penyarian disaring dengan corong dan ampas dari hasil penyarian ini dikeringkan dengan diangin-anginkan agar sisa kloroform menguap. Ampas kemudian dimaserasi dengan 3500 ml etanol 70 selama 3 x 24 jam dalam Erlenmeyer ditutup aluminium foil. Setelah disaring, maserat diuapkan dengan rotaevaporator hingga pekat. Maserat pekat kemudian diuapkan lagi di oven hingga diperoleh ekstrak kental. 6. Pembuatan sampel untuk KLT Pembuatan sampel untuk KLT dengan konsentrasi 10 dilakukan dengan melarutkan 0,5 g serbuk daun binahong dalam 5 ml etanol 70. 7. Identifikasi kualitatif senyawa ekstrak polar daun binahong dengan metode Kromatografi Lapis Tipis KLT

a. Uji KLT alkaloid

Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 dan fase gerak etil asetat: metanol: air 70:20:10. Sebagai pembanding digunakan skopolamin. Sampel dan pembanding ditotolkan bersama-sama pada lempeng KLT, kemudian dielusi dengan jarak 10 cm. Setelah itu dideteksi di bawah sinar UV 254 dan 365 nm, kemudian dideteksi dengan pereaksi semprot Dragendorff.

b. Uji KLT senyawa fenolik

Fase diam yang digunakan yaitu silika gel GF 254 dengan fase gerak toluen: etil asetat: metanol 70:20:10. Pembanding yang digunakan yaitu eugenol. Sampel dan pembanding ditotolkan bersama-sama kemudian dielusi dengan jarak 10 cm. Deteksi dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan pereaksi semprot besi III klorida. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI c. Uji KLT flavonoid Fase diam yang digunakan yaitu selulosa dengan fase gerak butanol: asam asetat glasial: air 4:1:5. Pembanding yang digunakan yaitu rutin. Sampel dan pembanding ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 10 cm. Setelah itu dideteksi dengan sinar UV 254 nm, UV 365 nm dan uap amonia. e. Uji KLT tanin Fase diam yang digunakan yaitu silika gel GF 254 dengan fase gerak etil asetat: metanol: air 100: 13,5: 10. Pembanding yang digunakan yaitu asam tanat 1. Sampel dan pembanding ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 10 cm. Setelah itu dideteksi dengan sinar UV 254 nm, 365 nm, dan pereaksi semprot besi III klorida.

8. Uji potensi ekstrak polar daun binahong terhadap B. subtilis dan P.

aeruginosa dengan metode difusi paper disk a. Pembuatan konsentrasi larutan uji Ekstrak polar daun binahong dengan konsentrasi 75, 50, dan 25 dibuat dengan mengencerkan ekstrak konsentrasi 100, sampai kadar yang diinginkan dalam volume 5 ml. Pembuatan konsentrasi 100 dilakukan dengan menimbang 10 g ekstrak kental kemudian dilarutkan dalam 10 ml CMC 1. Tabel I. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak polar daun binahong Konsentrasi Volume larutan uji yang diambil dari ekstrak 100 ml Volume CMC 1 ml Volume pengenceran ml 100 5,00 - 5 75 3,75 1,25 5 50 3,33 1,67 5 25 2,50 2,50 5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Sebagai kontrol negatif digunakan larutan CMC 1 dan kontrol positif amoksisilin 0,03 g1ml. b. Persiapan stok bakteri uji Diambil 1 ose bakteri dari biakan murni B. subtilis dan P. aeruginosa, kemudian masing-masing ditanam pada media nutrien agar miring, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C. c. Pembuatan suspensi bakteri uji B. subtilis dan P. aeruginosa Beberapa ose bakteri uji dari stok bakteri, kemudian diinokulasikan pada 2 ml media nutrien broth steril yang telah diinkubasi selama 24 jam suhu 37˚C, homogenkan dengan vortex, kemudian disesuaikan kekeruhannya dengan standar Mc. Farland II 6x 10 8 CFUml. Suspensi bakteri yang diperoleh telah siap diinokulasikan ke dalam media nutrien agar yang steril. d. Pembiakan suspensi B. subtilis dan P. aeruginosa secara spread plate Diambil 0,2 ml bakteri dari suspensi bakteri uji yang telah setara dengan larutan standar Mc. Farland II 6 x 10 8 CFUml, kemudian diinokulasikan secara spread plate ke dalam cawan petri yang berisi 20 ml media nutrien agar steril yang telah memadat. e. Pengujian potensi antibakteri Pengujian potensi antibakteri ekstrak polar daun binahong dilakukan dengan metode difusi paper disk. Ke dalam media padat yang telah berisi bakteri diberi paper disk. Setelah itu, kedalam paper disk ditetesi dengan seri konsentrasi senyawa uji sebanyak 20µl, sebagai kontrol positif digunakan amoksisilin dan kontrol negatif digunakan CMC 1 masing- masing sebanyak 20 µl, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Diukur diameter zona hambatnya menggunakan penggaris. f. Pengujian potensi antibakteri dengan metode dilusi padat Pada Erlenmeyer yang berisi 20 ml media nutrien agar steril dimasukkan 0,2 ml suspensi bakteri uji, kemudian tambahkan pula 1 ml larutan uji, campur dengan vortex. Masukkan campuran tersebut dalam cawan petri steril secara pour plate. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Diamati pertumbuhan bakteri yang terjadi dengan melihat kekeruhan yang dibandingkan dengan kontrol pertumbuhan bakteri. Pada hasil inkubasi yang jernih diambil satu ose dan ditanam secara streak plate pada media padat steril dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37º C kemudian diamati pertumbuhan bakteri sampai didapatkan nilai KHM dan KBM.

E. Analisis Hasil

Analisis uji potensi antibakteri ditunjukkan dengan data diameter zona hambat yang diperoleh dengan metode pengujian menggunakan difusi paper disk pada empat variasi konsentrasi larutan uji dengan tiga kali replikasi. Analisis hasil KLT dilakukan dengan menghitung harga Rf dan mengamati bercak yang timbul dari ekstrak polar daun binahong dan membandingkan dengan standar yang sesuai.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Tanaman

Daun binahong yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari kebun obat Balai Penelitian Tanaman Obat BPTO Tawangmangu, Karanganyar, Surakarta, Jawa Tengah. Diidentifikasi di BPTO menurut Backer 1968. Tujuan identifikasi tanaman ini untuk mencegah kesalahan tanaman yang akan digunakan dalam penelitian sehingga dapat dipastikan tanaman yang digunakan adalah binahong Anredera cordifolia Tenore Steen. Dari hasil identifikasi yang dilakukan berdasarkan acuan tersebut, tanaman binahong yang digunakan dalam penelitian adalah Anredera cordifolia Tenore Steen Lampiran 1.

B. Pengumpulan Bahan, Pengeringan, dan Pembuatan Serbuk

Daun binahong yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari tanaman binahong yang diperoleh dari kebun obat BPTO. Daun yang diperoleh berupa daun yang sudah dikeringkan. Pengeringan dapat dilakukan di bawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam atau dengan oven. Pengeringan dilakukan sampai keadaan daun mudah dipatahkan menggunakan tangan. Pengeringan dilakukan dengan tujuan untuk mengurangi kadar air simpleks sehingga tidak ditumbuhi fungi atau bakteri. Selain itu, pengeringan dilakukan untuk menghentikan reaksi enzimatis yang dapat merusak senyawa aktif tanaman, sehingga penurunan mutu simplisia dapat dicegah. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI