ditekan hati-hati, kemudian dituangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup
perkolator dan biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari
secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan hingga 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan
tidak meninggalkan sisa. Kemudian ampasnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan diperkolasi kembali menggunakan cairan penyari
etilasetat dengan prosedur perkolasi yang sama. Setelah perkolat etilasetat diperoleh, ampasnya diangin-anginkan kembali dan diperkolasi menggunakan
cairan penyari etanol dengan prosedur perkolasi yang sama. Masing-masing perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap rotary evaporator dan
dikeringbekukan dengan freeze dryer Ditjen POM, 1979.
3.8 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat gelas disterilkan didalam oven pada suhu
170°C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset disterilkan dengan lampu bunsen Lay, 1994.
3.9 Pembuatan Media 3.9.1 Media
nutrient agar NA
Komposisi : Bacto – Beef extract 3 g Bacto peptone
5 g Bacto – Agar
15 g
Universitas Sumatera Utara
Cara Pembuatan : Sebanyak 23 g sediaan NA ditimbang, disuspensikan kedalam air suling 1000
ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna. Kemudian media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama
15 menit Difco, 1953.
3.9.2 Media nutrient broth NB
Komposisi : Bacto beef extract 3,0 g
Bacto peptone 5,0 g
Cara Pembuatan: Sebanyak 8 g nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril sebanyak 1000 ml
kemudian dipanaskan hingga semua larut. Kemudian media dimasukkan kedalam erlenmeyer dan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C selama
15 menit Difco, 1953.
3.9.3 Media Mueller Hinton agar MHA
Komposisi: Beef infusion form 300 g Casein hydrolysate 17,5 g
Starch 1,5 g
Agar 17 g
Cara pembuatan: Sebanyak 38 g sediaan MHA ditimbang kemudian disuspensikan dalam
erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai
Universitas Sumatera Utara
terbentuk larutan jernih. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Difco, 1953.
3.10 Pembuatan Agar Miring
Kedalam tabung reaksi dimasukkan 10 ml media Nutrien Agar yang sudah dicairkan, kemudian diletakkan dengan posisi miring dengan kemiringan
lebih kurang 30-45 derajat, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas dan dibiarkan memadat Lay, 1994.
3.11 Pembuatan Stok Kultur Bakteri
Koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media nutrient agar miring dengan cara menggores. Kemudian
diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35-37
o
C selama 18-24 jam Ditjen POM, 1995.
3.12 Penyiapan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml larutan nutrient broth. Kemudian
diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25 Ditjen POM, 1995.
3.13 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak n-Heksana, Etilasetat dan Etanol
dengan Berbagai Konsentrasi
Sebanyak 2,5 g ekstrak n-heksana ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dengan pelarut DMSO yang diencerkan dengan etanol 96
1:1 dalam labu tentukur 5 ml hingga garis tanda dan diperoleh konsentrasi ekstrak 500 mgml. Selanjutnya dibuat pengenceran sampai diperoleh ekstrak
Universitas Sumatera Utara
dengan konsentrasi 400 mgml, 300 mgml, 200 mgml, 100 mgml, 90 mgml, 80 mgml, 70 mgml, 60 mgml, 50 mgml, 40 mgml, 30 mgml, 20 mgml dan
10 mgml. Dilakukan prosedur yang sama terhadap ekstrak etilasetat dan ekstrak etanol.
3.14 Pengujian Aktivitas Antibakteri secara In vitro
