Alat Bahan Pembuatan Ekstrak n-Heksana, Ekstrak Etilasetat dan Ekstrak Etanol

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang dilakukan adalah metode eksperimental yaitu suatu penelitian dengan melakukan kegiatan percobaan experiment yang bertujuan untuk mencari pengaruh variabel tertentu terhadap variabel lain dan penelitian dilakukan di laboratorium. Tahap penelitian meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi bahan tumbuhan, pembuatan simplisia, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak. Selanjutnya pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar menggunakan punch hole. Parameter yang dilihat adalah besarnya diameter hambat pertumbuhan bakteri. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan.

3.1 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Panasonic, bola karet, desikator, freeze dryer Modulio, inkubator Memmert, jangka sorong, jarum ose, kamera digital Kodak, bunsen, krus porselen, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF 1200L, lemari pendingin Glacio, mikroskop Olympus, neraca kasar, neraca listrik Mettler Toledo, oven Fisher, penangas air, pinset, pipet mikro Eppendorf, rotary evaporator Stuart, seperangkat alat penetapan kadar, silinder logam, spektrofotometer visibel Dynamica dan tanur Nabertherm. Universitas Sumatera Utara

3.2 Bahan

Bahan yang digunakan adalah talus alga merah Galaxaura oblongata, Nutrient agar NA, Nutrient broth NB, Mueller Hinton agar MHA, bakteri Staphylococcus aureus ATCC 29737 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 dan air suling. Bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa, kecuali dinyatakan lain: dimetilsulfoksida DMSO, amil alkohol, asam klorida pekat, asam asetat anhidrida, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, eter, etanol, etil asetat, n-heksana, isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, timbal II asetat dan toluena.

3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan

Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi bahan tumbuhan dan pembuatan simplisia talus alga merah Galaxaura oblongata.

3.3.1 Pengambilan bahan tumbuhan

Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan dari daerah lain. Bahan tumbuhan yang digunakan adalah talus Galaxaura oblongata Ellis et Solander Lamouroux yang diperoleh dari Desa Halodan, Kecamatan Pulau Banyak Barat, Kabupaten Singkil, Provinsi Nangroe Aceh Darussalam. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Identifikasi bahan tumbuhan

Identifikasi bahan tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi LIPI Jakarta. Identifikasi tumbuhan ini telah dilakukan oleh Violita Milala 2012 dan bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah alga Galaxaura oblongata Ellis et Solander Lamouroux. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 46.

3.3.3 Pembuatan simplisia

Talus Galaxaura oblongata yang telah dikumpulkan, direndam dalam air dan dibersihkan dari pengotor dan organisme yang melekat serta sisa-sisa karang yang menempel. Dicuci berkali-kali dengan air sampai bersih dan ditiriskan. Bahan tumbuhan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan terlebih dahulu kemudian dikeringkan di lemari pengering hingga kering. Selanjutnya simplisia diblender menjadi serbuk dan disimpan dalam kantung plastik. Bagan kerja pembuatan simplisia dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 50. 3.4 Pembuatan Pereaksi

3.4.1 Pereaksi Mayer

Larutan raksa II klorida P 2,266 bv sebanyak 60 ml dicampur dengan 10 ml larutan kalium iodida P 50 bv, kemudian ditambahkan air secukupnya hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.2 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida P dilarutkan dalam air secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium P kemudian ditambahkan air hingga 100 ml Depkes, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.4.3 Pereaksi Dragendorff

Larutan bismuth nitrat P 40 bv dalam asam nitrat P sebanyak 20 ml dicampur dengan 50 ml kalium iodida P 54,4 bv, didiamkan sampai memisah sempurna. Lalu diambil lapisan jernihnya dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.4 Pereaksi Molish

Sebanya k 3 g α-naftol P, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes, 1995.

3.4.5 Pereaksi besi III klorida 1 bv

Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air secukupnya hingga 100 ml Depkes, 1980.

3.4.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat P dilarutkan dalam air bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes, 1980.

3.4.7 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,001 g natrium hidroksida, dilarutkan dalam air secukupnya hingga 100 ml Depkes, 1980.

3.4.8 Pereaksi asam klorida 2 N

Larutan asam klorida pekat sebanyak 17 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.

3.4.9 Pereaksi asam sulfat 2 N

Larutan asam sulfat pekat sebanyak 9,808 g ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979. Universitas Sumatera Utara

3.4.10 Pereaksi Lieberman-Bourchard

Campurkan 5 ml asam sulfat pekat dengan 50 ml etanol. Tambahkan hati-hati 5 ml asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut Depkes, 1995.

3.4.11 Larutan kloralhidrat

Sebanyak 50 g kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1979.

3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar sari larut etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu tidak larut asam. Pemeriksaan karakteristik simplisia ini telah dilakukan oleh Violita Milala 2012.

3.5.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, warna, bau dan rasa simplisia alga merah.

3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia alga merah. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Gambar mikroskopik dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 49. Universitas Sumatera Utara

3.5.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluena. Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu yang berisi toluen jenuh tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Penyulingan dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa WHO, 1998.

3.5.4 Penetapan kadar sari larut air

Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air- kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dengan menggunakan botol bersumbat warna coklat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring, sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan hingga kering dalam cawan yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot Universitas Sumatera Utara tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995.

3.5.5 Penetapan kadar sari larut etanol

Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dengan menggunakan botol bersumbat berwarna coklat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan hingga kering dalam cawan yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995.

3.5.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam. Selanjutnya didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995.

3.5.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Universitas Sumatera Utara Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995. 3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan alkaloida Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi: 1. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer 2. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat 3. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas Depkes, 1995.

3.6.2 Pemeriksaan flavonoida

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 1 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah kekuningan atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.6.3 Pemeriksaan glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang, lalu disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95 dan 3 bagian air suling. Kemudian Universitas Sumatera Utara ditambahkan 10 ml HCl 2N dan direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 2 bagian isopropanol dan 3 bagian kloroform, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan ditambahkan Na 2 SO 4 anhidrat, disaring kemudian diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 o C, sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: sepersepuluh ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish, lalu ditambahkan dengan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon Depkes, 1995.

3.6.4 Pemeriksaan glikosida antrakinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring, kemudian kocok dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah menunjukkan adanya antrakinon Depkes, 1995.

3.6.5 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang Universitas Sumatera Utara dari 10 menit setinggi 1 sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang Depkes, 1995.

3.6.6 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1 . Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes, 1989.

3.6.7 Pemeriksaan steroidtriterpenoid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan eter 20 ml selama 2 jam, disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman-Bourchard, diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Apabila terbentuk warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Harborne, 1987.

3.7 Pembuatan Ekstrak n-Heksana, Ekstrak Etilasetat dan Ekstrak Etanol

Alga Merah Galaxaura oblongata Ellis et Solander Lamouroux Secara Perkolasi Bertingkat Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi bertingkat menggunakan tiga pelarut. Cara kerja: sebanyak 200 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituangi cairan penyari n-heksana sampai semua simplisia terendam sempurna dan dibiarkan sekurang-kurangnya selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali Universitas Sumatera Utara ditekan hati-hati, kemudian dituangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, tutup perkolator dan biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan hingga 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan tidak meninggalkan sisa. Kemudian ampasnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan diperkolasi kembali menggunakan cairan penyari etilasetat dengan prosedur perkolasi yang sama. Setelah perkolat etilasetat diperoleh, ampasnya diangin-anginkan kembali dan diperkolasi menggunakan cairan penyari etanol dengan prosedur perkolasi yang sama. Masing-masing perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap rotary evaporator dan dikeringbekukan dengan freeze dryer Ditjen POM, 1979.

3.8 Sterilisasi Alat