17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pharmacy Drug and Research PDR, Laboratorium Pharmacy Natural Analyzing PNA, dan
Laboratorium Pharmacy Medicinal Chemitry PMC Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta,
Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor, pada bulan Juni sampai dengan September
2012.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator Eyela, autoklaf tipe vertikal mode TA – 630, ultrasentrifus Sorvall RC - 26
plus, microplate reader Multiscan EX Thermo, microtiter plate Polycarp, pipet mikro Gilson, Laminar Air Flow ESCO, sonikator LabSonic, shaker
incubator N-Biotek, freezer -20°C Sansio, SDS-PAGE [ATTO], hot plate magnetic stirrer Cimarec, timbangan analitik Acis, tabung 1,5 mL
Eppendorf, tabung 50 mL Falcon, spatula, erlenmeyer Pyrex, gelas ukur Duran, corong Duran, dan kertas saring.
3.2.2 Bahan
Kulit buah manggis, n-heksan teknis, etil asetat teknis, metanol teknis, bakteri E. coli BL21 DE3 pLysS - RNA helikase HCV rekombinan koleksi
Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI, akuades, media Luria-Bertani LB, ampisilin, IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase 0,3 M, dapar B Tris
HCl 10 mM pH 8,5, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25, resin TALON,
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dapar elusi imidazola 400 mM dalam bufer B, Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, akrilamid 30, sodium dedosil sulfat SDS 10, TEMED, amonium persulfat
APS 10, comassie blue, loading dye, adenosin trifosfat ATP 0,1 mM, 4- asam morfolinopropana sulfonat MOPS 0.1 mM, MgCl
2
1 mM, larutan malachite green, polivinil alkohol 2,3, amonium molibdat, natrium sitrat, dan
metanol absolut.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel
Buah manggis Garcinia mangostana L. diperoleh dari Kecamatan Wanayasa, Kabupaten Purwakarta, Provinsi Jawa Barat. Adapun bagian yang
digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah pericarp manggis.
3.3.2 Determinasi Sampel
Determinasi buah manggis Garcinia mangostana L. dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong.
3.3.3 Pembuatan Simplisia
Buah manggis Garcinia mangostana L. sebanyak 5 kg disortir dan dibersihkan dari kotoran yang melekat dengan air mengalir, lalu ditiriskan agar
terbebas dari sisa air cucian. Kemudian bagian kulit buahnya pericarp, dirajang tipis, dan diangin-anginkan di udara terbuka hingga kering. Simplisia
yang sudah kering kemudian digiling dan diayak untuk mendapatkan serbuk halus, lalu simplisia disimpan pada wadah yang kering dan tertutup rapat.
3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis Garcinia mangostana L.
Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buah manggis Garcinia mangostana L. dimaserasi dengan 5 x 800 mL n-heksan teknis yang telah
didestilasi, selama 3 hari. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu lebih kurang 45°C, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan. Ampas n-heksan yang diperoleh diuapkan di
udara terbuka hingga kering, kemudian dilakukan kembali maserasi berturut- turut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Kemudian filtrat diuapkan dengan
rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan metanol yang kemudian ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat
simplisia awal Materia Medika, 1989. Rendemen
=
x 100
3.3.5 Penapisan Fitokimia
1. Identifikasi Alkaloid Ekstrak ditambahkan dengan 5 mL ammonia 30, digerus dalam mortir,
lalu tambahkan 20 mL kloroform dan digerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan kertas saring, filtrat berupa larutan organik di ambil
sebagai larutan A, sebagian dari larutan A 10 mL diekstraksi dengan 10 mL larutan HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambil larutan bagian
atasnya larutan B. Larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan disemprot atau ditetesi dengan pereaksi Draggendorff, terbentuk warna merah
ataupun jingga pada kertas saring menunjukan adanya senyawa alkaloid. Larutan B dibagi dalam 2 tabung reaksi, ditambahkan masing-masing pereaksi
Dragendrorff dan Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi Dragendrorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukan adanya
senyawa golongan alkaloid Farnsworth, 1966. 2. Identifikasi Flavonoid
Ekstrak ditambahkan 100 mL air panas, kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring dengan kertas saring. Sebanyak 5 mL filtrat yang didapat
ditambahkan serbuk atau lempeng magnesium dan 1 mL HCl pekat serta 5 mL amil alkohol, kemudian dikocok dengan kuat, dibiarkan hingga memisah.
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Terbentuknya warna dalam larutan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid Farnsworth, 1966.
3. Identifikasi Saponin Ekstrak ditambahkan 10 mL akuades dalam tabung reaksi. Kemudian
diguncang selama 1 - 2 menit. Adanya saponin diindikasikan oleh terbentuknya buih setinggi 1 cm yang stabil selama 30 menit El Kamali et al, 2010.
4. Identifikasi Tanin Ekstrak dilarutkan dalam 20 mL akuades. Filtrat sebanyak 2 mL
ditambahkan 3 tetes FeCl
3
10. Terbentuknya warna biru kehitaman atau hijau kehitaman mengindikasikan adanya tanin. Cara yang lain adalah 2 mL filtrat
ditambahkan 1 mL larutan brom, apabila terdapat endapan maka positif mengandung tanin Adegboye et al, 2008.
5. Identifikasi Steroid Ekstrak dilarutkan dalam 3 mL CHCl3 kemudian disaring. H
2
SO
4
ditambahkan ke dalam filtrat. Terbentuknya cincin coklat kemerahan menandakan positif adanya steroid Magadula and Tewtrakul, 2010.
6. Identifikasi Kumarin Ekstrak dilarutkan dalam air panas. Setelah dingin, larutan dibagi ke
dalam dua tabung reaksi yaitu tabung 1 sebagai blanko dan tabung 2 ditambah 0,5 mL NH
3
10. Adanya pijaran yang kuat dibawah sinar UV menunjukkan adanya kumarin dan turunannya Indrayani et al, 2006.
3.3.6 Penetapan Parameter Spesifik dan Non Spesifik Ekstrak Kulit Buah Garcinia mangostana L.
1. Pemeriksaan organoleptik Pemeriksaan organoleptik dilakukan menggunakan pancaindra untuk
mendeskripsikan bentuk, warna, dan bau dari ekstrak kulit buah manggis.
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Susut Pengeringan Ekstrak kulit buah manggis ditimbang dengan seksama sebanyak 1 gram
dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105°C selama 30 menit dan telah ditara. Ekstrak
diratakan dalam botol timbang dengan menggoyang-goyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm,
kemudian dimasukkan ke dalam oven, dibuka tutupnya. Pengeringan dilakukan pada suhu penetapan 105°C hingga diperoleh bobot tetap lalu
ditimbang. Sebelum setiap pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar Depkes RI, 2000.
3. Kadar Abu Ekstrak ditimbang seksama sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam
krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, lalu ekstrak diratakan. Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, lalu ditimbang.
Jika arang tidak dapat hilang, ditambahkan air panas, disaring dengan menggunakan kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa abu dan kertas saring
dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan, dipijarkan hingga bobot tetap lalu ditimbang. Ditimbang kadar abu terhadap
bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 2000.
3.3.7 Produksi RNA helikase virus hepatitis C HCV Utama et al, 2000
Media LB Luria –Bertani dibuat dengan volume 10 mL dan 400 mL lampiran 9a. Perkultur dibuat dalam media LB sebanyak 10 mL. Media LB
diberi ampisilin 100 µgmL sebanyak 10 µL dan dihomogenkan. Lalu diinokulasikan bakteri E. coli BL21 DE3 pLysS-RNA helikase rekombinan,
kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan kecepatan 200 rpm selama semalam.
Hasil prekultur diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB yang telah diberi ampisilin 100 µgmL sebanyak 410 µl, kemudian diinkubasi dalam
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan kecepatan 150 rpm, selama 30 menit atau hingga OD
600
optical density mencapai ± 0,3. Selanjutnya ditambahkan 0,3 M IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase, kemudian
diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37°C dengan kecepatan 150 rpm selama 3 jam atau hingga OD
600
mencapai ± 1. Hasil kultur disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 4.000
rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan sisa medium LB cair, kemudian disentrifugasi kembali. Pelet yang terbentuk disimpan dalam
temperatur -20°C. Pelet hasil sentrifugasi selanjutnya dikeringbekukan freeze-thawing
sebanyak tiga kali. Pelet diresuspensi dengan dapar B kemudian disonikasi sebanyak 3 kali pengulangan dengan amplitudo 40; siklus 0,5; selama 15 detik,
dengan interval waktu 1 menit. Suspensi sel disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit.
Supernatan yang diperoleh kemudian dipurifikasi dengan kromatografi afinitas. Supernatan ditambahkan dengan 300 µL resin TALON resin
ekuilibrasi, kemudian diinkubasi pada rotator cold room 4°C selama 3 jam, kemudian disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 7
menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebagai inner volume IV disimpan pada temperatur 4°C untuk SDS-PAGE. Pelet diresuspensi dengan 10 mL
larutan dapar B dan disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebagai washing 1. Pelet yang
terbentuk kemudian diresuspensi kembali dengan 10 mL larutan dapar B dan disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit.
Supernatan diambil sebagai washing 2. Hasil washing 1 W1 dan washing 2 W2 kemudian disimpan pada temperatur 4°C dan digunakan pada SDS-
PAGE. Pelet kemudian dielusi untuk melepaskan enzim yang terikat pada resin
dengan menambahkan 150 µL larutan dapar elusi dan diinkubasi pada rotator
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
cold room 4°C selama satu malam. Kemudian disentrifugasi pada temperatur 4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh
diambil sebagai elusi 1 E1 sedangkan pelet ditambahkan 75 µL larutan dapar elusi kembali, kemudian diinkubasi pada rotator cold room 4°C selama 1 jam.
Kemudian disentrifugasi kembali pada temperatur 4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh diambil sebagai elusi 2 E2.
3.3.8 Konfirmasi kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan SDS – PAGE
Plat kaca yang digunakan terdiri dari short plate spacer plate dibersihkan dengan alkohol 70. Short plate ditempatkan di depan kaca spacer
plate dan diberi casting frame pada bagian tengah dengan dikunci dengan menggunakan casting stand. Selanjutnya dibuat larutan gel separating
lampiran 8a. Larutan tersebut dimasukan di antara celah short plate spacer plate sampai dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan akuades.
Kemudian ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit. Selanjutnya larutan gel stacking dibuat sesuai prosedur lampiran 8b. Akuades pada gel
separating dibuang dan diisikan dengan larutan stacking, kemudian dipasang comb, ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit.
Gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada casting frame. Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly
dengan posisi short plate menghadap dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame.
Lower inner chamber dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution Dapar Elektroforesis SDS 1X pH 8.3.
Masing-masing sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase HCV inner volum, whasing, dan elusi enzim diambil 4 µl lalu dicampur
dengan 2 µl loading dye lampiran 8c. Campuran didenaturasi di water bath pada suhu 95˚ C selama 15 menit. Marker protein BIORAD
®
sebanyak 4 µlgel dimasukan ke dalam well. Masing-masing sampel yang sudah dicampur
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan loading dye, dimasukan ke dalam well sebanyak 5 µlwell. Gel dielektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam
dalam Commasie Blue G-250 Staining Solution lampiran 8d selama 1 jam sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel dibilas dengan Commasie Blue G-
250 Destaining Solution lampiran 8e ± 20 menit, dilakukan dua kali. Gel dibilas dengan H
2
O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4°C.
3.3.9 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C Utama et al, 2000
Uji aktivitas enzim RNA helikase dilakukan dengan metoda ATPase kolorimetri. Sebanyak 50 µL campuran reaksi yang mengandung 5 µL dapar
MOPS 10 mM pH 6,6, 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H
2
O, dan 5 µL RNA helikase HCV, dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well.
Campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar 10 menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari
0,081 malachite green, H
2
O, 5,7 amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3 polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1 lampiran 9d. Setelah
masa inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit.
Setelah masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25 µL Na sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan
referensi 405 nm.
3.3.10 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV Utama et al, 2000
Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase dilakukan dengan menggunakan ATPase kolorimetri. Sebelum
dilakukan pengukuran absorbansi, terlebih dahulu ekstrak kulit buah manggis pada fase n-heksan, etil asetat, dan metanol masing-masing dilarutkan
menggunakan metanol absolut dengan beberapa konsentrasi yaitu 100.000
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ppm, 50.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 781 ppm, 391 ppm.
Pada pengukuran absorbansi enzim RNA helikase ini dilakukan dengan menambahkan 5 µL ekstrak kulit buah manggis dengan berbagai
konsentrasi pada setiap sumur dalam campuran reaksi. Volum akhir reaksi adalah 50 µL yang terdiri dari 45 µL campuran reaksi 5 µL dapar MOPS 10
mM pH 6,6, 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H
2
O, dan 5 µL RNA helikase HCV. Reaksi kemudian dimasukkan ke dalam microtiter plate
96-well. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar 10 menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari
0,081 malachite green, H
2
O, 5,7 amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3 polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah masa inkubasi
selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit. Setelah
masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25 µL Na sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm.
Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung presentasi inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV.
Perhitungan persen penghambatan sampel ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase dilakukan berdasarkan perhitungan :
inhibisi =
–
x 100 Dimana :
A = serapan enzim RNA helikase tanpa adanya senyawa inhibitor
I = serapan enzim RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor.
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori