Kolorimetri ATPase SDS - PAGE

15 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.5 Kolorimetri ATPase

Uji kolometrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang tidak menyerap cahaya. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi yang berwarna seperti malachite green dan amonium molibdat. Uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan warna yang muncul karena suatu zat warna tidak berwarna ditambah dengan pereaksi sehingga produknya berwarna Utama et al, 2000.

2.6 SDS - PAGE

SDS-PAGE Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis adalah suatu teknik yang banyak digunakan dalam biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas elektroforesis fungsi dari panjang rantai polipeptida atau bobot molekul. Sampel elektroforesis gel SDS memiliki muatan identik per satuan massa akibat pengikatan sampel dengan SDS dan di fraksinasi berdasarkan ukuran Deyl, 1983. Prinsip elektroforesis gel SDS poliakrilamid adalah protein yang akan dianalisis dicampur dengan SDS yang merupakan sebuah deterjen anionik. Soodium dodesil sulfat mendenaturasi struktur tersier, sekunder dan ikatan non- sulfida. Elektroforesis gel SDS poliakrilamid menerapkan muatan negatif untuk setiap protein dalam proporsi dengan massanya. Pemanasan sampel pada suhu kurang lebih 60°C memecah molekul dan membantu SDS untuk mengikat sampel. Penanda berupa pewarna dapat ditambahkan ke dalam larutan protein untuk memungkinkan eksperimen dalam melihat migrasi protein melalui gel selama elektroforesis dijalankan. Pewarna berukuran lebih kecil dibandingkan ukuran protein Laemmeli, 1970 16 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Medan Listrik listrik diterapkan di seluruh gel, menyebabkan protein bermuatan negatif bermigrasi di gel menuju anoda. Setiap protein akan bergerak secara berbeda melalui matriks gel. Protein pendek akan lebih mudah melalui pori-pori pada gel, sedangkan yang lebih besar akan memiliki sulit melalui pori. Setelah mencapai waktu yang ditentukan, protein akan bermigrasi berdasarkan ukuran. Protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauah di bawah gel, sedangkan yang lebih besar akan lebih dekat ke titik asal. Oleh karena itu, protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekulnya. Glikoprotein tertentu berperilaku sebaliknya pada gel SDS. Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu Comassie Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi pita protein dengna konsentrasi 50 mg protein. Pewarnaan perak Silver Staining meningkatkan sensitivitas pewarnaan biasanya 50 kali. Banyak variabel yang dapat mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein memiliki karakteristik pewarnaan sendiri Hempelmann, 1984. 17 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN