31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.4 Parameter Standar Ekstrak
Parameter standar yang diidentifikasi dari kulit buah manggis dapat dilihat dari tabel 4.3.
Tabel 4.3 Parameter Standar Ekstrak Jenis Karakteristik
Ekstrak n-heksan
Ekstrak etil asetat
Ekstrak metanol
Menurut literatur
Parameter Spesifik : a.Organoleptik
- Bentuk
-Warna
Parameter Non spesifik :
a.Susut pengeringan b. Kadar abu
Ekstrak kental
Kuning
0,5 0,4
Ekstrak kental
Kuning
2,1 0,7
Ekstrak kental
Coklat
9,3 2,2
max10 DepkesRI,2000 -
4.5 Produksi RNA Helikase Virus Hepatitis C
Produksi denganRNA helikase HCV dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan enzim RNA helikase yang murni yang digunakan sebagai
komponen dalam penentuan aktivitas inhibisi terhadap aktivitas ATPase. Ekspresi RNA helikase dilakukan dengan cara mengultur bakteri
Escherichia coli BL21 DE3 pLysS-RNA helikase HCV. Tahapannya dimulai dengan pre kultur yang dilakukan dalam medium cair Luria-Bertani LB yang
merupakan media yang sesuai dengan bakteri Escherichia coli, karena mengandung zat kompleks tripton, yeast extract, dan natrium klorida untuk
pertumbuhan bakteri. Media LB terlebih dahulu diberikan ampisilin yang berfungsi sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E. coli BL21 DE3
pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang juga mengandung gen resisten
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ampisilin, sehingga hanya bakteri E. coli BL21 DE3 pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang membawa gen RNA helikase HCV saja yang dapat
tumbuh. Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang pada temperatur 37°C dengan kecepatan 200 rpm selama semalam, kondisi ini merupakan kondisi
optimum untuk pertumbuhan bakteri Pelzar Chan,1986. Tahap berikutnya merupakan pemindahan kultur pada medium LB yang
lebih besar, medium yang telah diberi ampisilin kemudian ditambahkan pre kultur dan diinkubasi kembali pada temperatur 37°C dengan kecepatan 200 rpm
hingga nilai OD
600
optical density mencapai 0,3 atau pada saat bakteri mencapai fasa logaritmik, fase ini merupakan fasa awal dimana bakteri Escherichia coli
tumbuh. Pada
fasa ini,
kultur ditambahkan
IPTG Isopropyl-β-D-
Thiogalaktopiranosidase sebagai penginduksi untuk menghasilkan ekspresi berlebih pada kultur, sehingga dihasilkan jumlah enzim RNA helikase yang lebih
besar hingga fase awal stasioner dimana nilai OD
600
mencapai 1 Utama et al, 2000.
Bakteri E. coli dipanen dengan cara sentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan sel E. coli
dengan media LB. Setelah disentrifugasi sel E. coli akan mengendap sebagai pelet, sedangkan medium LB akan terpisah menjadi supernatan. Pelet yang
terbentuk kemudian disimpan dalam freezer dengan temperatur -20°C untuk menjaga stabilitas RNA helikase HCV yang terekspresi secara intraseluler dalam
pelet. RNA helikase yang terkandung dalam pelet harus dipurifikasi terlebih
dahulu sebelum menjadi target analisis. Untuk memurnikannya sel pelet dipecahkan dengan cara mekanik, yaitu dengan cara freeze-thaw dan sonikasi.
Freeze-thaw atau pengeringbekuan dilakukan menempatkan sel pada temperatur -20°C dan suhu ruang secara bergantian, masing-masing selama 20 menit
sebanyak tiga kali pengulangan. Freeze-thaw menyebabkan terbentuknya kristal es pada sel pelet sehingga akan melunakkan dinding sel bakteri yang
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mempermudah dalam pelisisan sel. Tahap selanjutnya merupakan sonikasi yang dilakukan menggunakan sonikator. Proses sonikasi akan merusak organel sel
namun tidak merusak integritas kemampuan fungsionalnya. Pada tahap sonikasi, enzim RNA helikase HCV disuspensikan terlebih dahulu dengan dapar
B 10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25 Tween 20. Tris HCl berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA helikase
sehingga stabilitasnya terjaga, natrium klorida berperan untuk menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik dengan RNA
helikase Vanz et al, 2008. Sedangkan tween 20 merupakan detergen non-ionik yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran sel. Rusaknya lipid
bipolar akan menyebabkan disosiasi membran sel dengan bagian hidrofobik dari RNA helikase yang sebelumnya menempel pada lipid bipolar tersebut Sigma
aldrich, 2008. Enzim selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi afinitas metal
affinity. Metode ini didasarkan pada pengikatan spesifik logam Co
2+
yang dimiliki resin TALON dengan label 6xHis-tag yang terdapat pada ujung RNA
helikase. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan
3500 rpm selama 7 menit. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Pelet
ditambahkan dapar elusi imidazol dalam dapar B ditambahkan untuk menghilangkan protein selain enzim RNA helikase. Imidazol yang terdapat
dalam dapar elusi ini memutuskan ikatan antara RNA helikase dengan resin TALON. Imidazol berperan sebagai analog residu His yang terdapat pada enzim
yang telah diikat oleh logam Co
2+
. Sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit digunakan untuk memisahkan imidazol dengan enzim
yang telah murni. Penggunaan kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya Sambrook Russel, 2001.
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Kemurnian enzim RNA helikase HCV dapat dikonfirmasi dengan menggunakan SDS-PAGE, berdasarkan protein target yang dituju. Elektroforesis
dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi 8. Hasil SDS-PAGE pada gambar 4.1 menunjukkan pita protein tunggal dengan bobot 54 kDa.
sehingga dapat dikatakan bahwa RNA helikase telah berhasil dipurifikasi dan sesuai dengan hasil seperti yang dilaporkan Utama et al, 2000 yang menyatakan
bahwa bobot molekul RNA helikase adalah sebesar 54 kDa. Pada lajur pertama berupa marker BIORAD
®
yang digunakan. Inner volum IV merupakan supernatan hasil sentrifugasi pada proses pemecahan sel yang belum dimurnikan
dengan resin TALON sehingga banyak mengandung metabolit interseluler yang menyebabkan penumpukan pita protein. Washing 1 dan washing 2 merupakan
hasil pencucian binding resin TALON tidak terdapat pita protein, karena supernatan hanya terdapat dapar B.
Gambar 4.1. SDS – PAGE RNA helikase HCV Keterangan : M = Marker, E1 = Elusi 1, E2 = Elusi 2, IV = Inner Volum,
W1 = washing 1, W2 = washing 2 54 kDa
M E1
E2 IV
W1 W2
50 kDa 75 kDa
100 kDa 150 kDa
250 kDa
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.6 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis Terhadap RNA Helikase Virus Hepatitis C
Kategori