Maksud dan tujuan analisis dengan KCKT hanya ada dua hal yaitu didapatnya pemisahan yang baik dalam waktu proses yang relatif singkat.
2.4 Cara Kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Pemisahan solute-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara
tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran
sampel Gandjar san Rohman, 2007.
2.5 Jenis-jenis Kromatografi
Menurut Gandjar dan Rohman 2007 jenis-jenis kromatografi yaitu :
2.5.1 Kromatografi Padatan Cair LSC
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silikagel atau alumina.Kromatografi Lapisan Tipis TLC adalah
salah satu bentuk dari LSC.dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particular.sebagian besar dari KCKT sekarang
ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel microparticulate. lebih kecil dari 20µ. Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut
organik dan tidak terionisasi.teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.
Universitas Sumatera Utara
2.5.2 Kromatografi Partisi
Partisi merupakan proses adsorpsi yang analog dengan proses ekstraksi pelarut. Fase diam cair diikatkan pada padatan lapis tipis yang lemban
inert.teknik ini tergantung pada partisi zar padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai fase diam dan yang
lainnya sebagai fase gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair LSC, fase diamnya dibuat dengan cara yang sama dengan pendukung pada kromatografi gas
GC. fase diam polar atau non polar dilapisi suatu pendukung inert dan dipak dalam suatu kolom. kemudian fase gerak dilewatkan melalui kolom. bentuk
kromatogram partisi ini disebut kromatografi cair-cair LLC. Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan
lama, telah dikembangakan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase
terikat BPC= Bonded Phase Chromatography. BPC dapat dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling popular dari KCKT. Kromatografi partisi LLC dan
BPC, disebut “fase normal” Bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan “fase terbalik” bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.
2.5.3 Kromatografi penukar ion
Pertukaran ion merupakan proses yang mana solut-solut ion dalam fase gerak dapat bertukar dengan ion-ion yang bermuatan sama ang terikat secara
kimiawi pada fase diam. fase diam dapat berupa padatan polimer yang permeable seperti resin organik yang tidak larut atau silika yang dimodifikasi secara kimiawi.
fase diam yang mengandung gugus-gugus dengan muatan yang tetap dan ion-ion lawannya.
Universitas Sumatera Utara
2.5.4 Kromatografi eksklusi
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasigel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul
2000 dalton.fase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimar yang bersifat porus sehingga solute dapat melewati porus lewat diantara partikel, atau
berdifusi lewat fase diam. molekul solute yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. hal ini disebabkan solute dengan BM yang jauh lebih besar, tidak melewati porus, akan tetapi lewat
diantara fase diam. dengan demikian, dalam pemisahan dengan ekslusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solute dan fase diam seperti tipe kromatografi
yang lain. 2.5.5 Kromatografi Pasangan Ion IPC
Kromatografi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970.Diterimanya IPC
sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga
kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatografhi PIC. Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.
popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya seperti
senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa basa kuat.
Universitas Sumatera Utara
2.6 Komponen Kromatografi cair kinerja tinggi
Menurut Rohman 2009 Sistem peralatan KCKT pada dasarnya terdiri atas :
2.6.1 Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert.Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-
partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan
detektor sehingga akan mengacaukan analisis. 2.6.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yakni pompa harus inert terhadap fase
gerak. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan.
2.6.3 Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik.
Universitas Sumatera Utara
2.6.4 Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solutanalit. 2.6.5 Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor universalyang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif.
2.6.6 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir kedetektor dan dicatat sebagai puncak- puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram Johnson dan
Stevenson, 1991. Guna Kromatogram :
1. Kualitatif
Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatogram yang sama dapat digunakan untuk identifikasi
2. Kuantitatif
Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi Johnson dan Stevenson,
1991.
Universitas Sumatera Utara
2.7 Analisa Kualitatif dan Kuantitatif
1. Analisa Kualitatif
Ada tiga pendekatan untuk analisis kualitatif yaitu : a.
Perbandingan antara data retensi solute yang tidak diketahui dengan data retensi baku yang sesuai senyawa yang diketahui pada kondisi yang
sama. Waktu retensi atau volume retensi senyawa baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi dengan cara
berurutan dalam kondisi alat yang stabil dengan perbedaan waktu pengoperasian antara keduanya sekecil mungkin.
b. Dengan cara spiking
Untuk Kromatografi yang melibatkan kolom, spiking dilakukan dengan menambah sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan
diselidiki dengan senyawa baku pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara : pertama, dilakukan proses kromatografi
sampel yang tidak di spiking. kedua, sampel yang telah di spiking dengan senyawa baku dilakukan proses kromatografi. Jika pada puncak tertentu
yang diduga mengandung senyawa yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncakluas puncak setelah di spiking dibandingkan dengan tinggi
puncakluas puncak yang tidak dilakukan spiking maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki.
c. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa
Pada pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi, cara ini akan memberikan informasi data spektro massa solute dengan waktu retensi
tertentu. Spektro solute yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan
Universitas Sumatera Utara
spektro yang ada di database computer atau diinterupsi sendiri. Cara ini dapat dilakukan untuk solute yang belum ada baku murninya
Rohman, 2009. 2.
Analisa Kuantitatif Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif
stabil dan reprodusible, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisa
kuantitatif : a.
Analit solut harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen- komponen lain dalam kromatogram
b. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia
c. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan
Sementara Kromatografi yang melibatkan kolom, kuantifikasi dapat dilakukan dengan cara : Luas puncak atau dengan tinggi puncak. Tinggi
puncak atau luas puncak berbanding langsung dengan banyaknya solute yang dikromatografi, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linear.
2.8 Validasi Metode
