III. METODOLOGI
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian utama dan bahan-bahan yang digunakan
dalam tahap persiapan bahan baku. Bahan-bahan penelitian utama terdiri dari polimer PHA hasil tahap persiapan bahan baku, kloroform Merck, dan
PEG 400 Merck. Bahan-bahan tahap persiapan bahan baku terdiri dari hidrolisat pati sagu diagram alir proses pembuatan hidrolisat pati sagu dapat
dilihat pada Lampiran 1, galur bakteri Ralstonia eutropha IAM 12368,
NaOCl 0,2 , metanol, kloroform, air destilata, dan bahan-bahan kimia lainnya yang digunakan untuk proses produksi PHA Tabel 2.
Peralatan yang digunakan dalam penelitian utama terdiri dari pipet mikro 1 ml dan 20 µl, pipet gelas 10 ml, penangas, pendingin tegak, botol
kecil volume 20 ml, magnetik stirer ukuran 1 cm, dan cetakan kaca. Peralatan yang digunakan pada tahap persiapan bahan baku meliputi peralatan untuk
pembuatan hidrolisat pati sagu dan kultivasi R. eutropha. Pada pembuatan hidrolisat pati sagu, peralatan yang digunakan antara lain gelas piala 1 liter,
magnetic stirrer, labu erlenmeyer 250 ml, corong Buchner, kertas saring, kertas pH, alumunium foil, termometer, water bath shaker, dan penangas.
Kultivasi dilakukan dengan mengunakan bioreaktor “B-Braun Biostat V tipe 880 1371” volume kerja 10 liter dengan peralatan pendukung seperti labu
erlenmeyer 250 ml dan 1 liter, gelas piala 1 liter, gelas ukur, tabung reaksi, kapas, alumunium foil, dan pH meter. Pada proses hilir, sentrifugasi
dilakukan dengan mesin sentrifuse “SORVAL” dengan kode rotor GSA. Peralatan yang digunakan untuk karakterisasi bioplastik PHA terdiri
dari mikrometer sekrup, penggaris, dan neraca analitik untuk mengukur densitas. Kuat tarik dan perpanjangan putus diukur dengan UTM Universal
Testing Machine, FTIR Fourier Transform Infra-Red Spectroscopy untuk analisa gugus fungsi, DSC Differential Scanning Calorimetry untuk analisa
T
m
melting point dan T
g
glass transition temperature.
B. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap yaitu tahap persiapan bahan baku dan penelitian utama. Tahap persiapan bahan baku bertujuan untuk
memproduksi polimer PHA yang kemudian akan digunakan pada penelitian utama. Penelitian utama merupakan pembuatan bioplastik dengan PEG 400
sebagai pemlastis dan kloroform sebagai pelarut.
1. Tahap Persiapan Bahan Baku
Bahan baku utama yang diperlukan untuk penelitian ini adalah polimer PHA. Polimer ini diperoleh dengan cara melakukan kultivasi
Ralstonia eutropha secara terumpan fed-batch dan menggunakan hidrolisat pati sagu sebagai sumber karbon. Bahan baku disiapkan melalui
tiga tahapan proses, yaitu persiapan media, kultivasi Ralstonia eutropha secara fed-batch dan proses hilir PHA.
a. Persiapan Media
Persiapan media meliputi proses pembuatan hidrolisat pati sagu secara enzimatis serta persiapan kultur dan media kultivasi.
i. Pembuatan Hidrolisat Pati Sagu
Metode pembuatan hidrolisat pati sagu dilakukan berdasarkan hasil penelitian Akyuni 2004. Diagram alir pembuatan hidrolisat
pati sagu dapat dilihat pada Lampiran 1. Sedangkan prosedur pengukuran total gula dari hidrolisat pati sagu sirup glukosa dapat
dilihat pada Lampiran 2.
ii. Persiapan Kultur dan Media Kultivasi
Galur bakteri yang digunakan adalah Ralstonia eutropha IAM 12368 yang diperoleh dari IAM Culture Collection, Institute of
Molecular and Celular Bioscience, The University of Tokyo. Kultur bakteri R. eutropha dipelihara dalam media cair nutrient broth yang
disimpan pada suhu 4 C dan disegarkan setiap 2 minggu sekali.
Media kultivasi yang digunakan merupakan formulasi terbaik hasil penelitian Atifah 2006.
Hidrolisat pati sagu digunakan sebagai
sumber karbon, NH
4 2
HPO
4
sebagai sumber nitrogen serta NH
4 2
HPO
4
dan KH
2
PO
4
sebagai sumber fosfat. Larutan mikroelemen dalam gL HCl 1 N terdiri dari 2,78 g
FeSO
4
.7H
2
O, 1,98 g MnCl
2
.4H
2
O, 2,81 g CoSO
4
.7H
2
0, 1,67 g CaCl
2
.2H
2
O, 0,17 g CuCl
2
.2H
2
O, dan 0,29 g ZnSO
4
.7H
2
O. Setiap media kultivasi ditepatkan pH-nya menjadi 7,0 dengan NaOH 4 M
dan H
3
PO
4
1,33 N. Komposisi media kultivasi dapat dilihat pada Tabel 2. Hidrolisat pati sagu dan media garam mineral disterilisasi
dalam otoklaf menggunakan wadah terpisah pada suhu 121 C
selama 15 menit. Selanjutnya media didinginkan sampai pada suhu ruang dan siap digunakan sebagai media propagasi maupun media
kultivasi. Tabel 2. Formulasi media kultivasi Atifah, 2006
Bahan Konsentrasi per liter media
K
2
HPO
4
KH
2
PO
4
MgSO
4
0,1 M Mikroelemen
Total gula NH
4 2
HPO
4
5,8 g 3,8 g
10 ml 1 ml
30 g 5,66 g
b. Produksi PHA Secara Fed-Batch Atifah, 2006
Kultivasi Ralstonia eutropha dengan sistem kultivasi terumpan fed-batch dilakukan pada bioreaktor volume kerja 10 liter.
Pengumpanan hidrolisat pati sagu dilakukan berdasarkan Atifah 2006, yaitu pada saat mikroba diperkirakan memasuki fase pertumbuhan
stasioner atau pada saat jam ke 48. Hidrolisat pati sagu yang diumpankan dengan volume tertentu setara dengan kadar total gula 20 g
per liter media. Diagram alir proses kultivasi Ralstonia eutropha secara fed-batch dapat dilihat pada Lampiran 3.
Kultivasi dilakukan selama 96 jam dengan aerasi sebesar 0,2 vvm, agitasi 150 rpm, pH 6,5-7,5 dan suhu bioreaktor 37
C. Pengecekan kondisi proses dilakukan setiap 12 jam dan bila timbul busa yang cukup
banyak di dalam bioreaktor dapat ditambahkan larutan anti busa secukupnya. Pengendalian pH dilakukan secara otomatis, larutan alkali
yang disiapkan adalah NaOH 4 M sedangkan larutan asamnya adalah H
3
PO
4
1,33 N.
c. Proses Hilir PHA Modifikasi dari Atifah 2006, Hahn et al. 1994, dan
Ramsay et al. 1992
Setelah proses kultivasi selesai jam ke 96, cairan kultivasi disentrifugasi sebanyak empat tahapan. Setiap tahapan sentrifugasi
dilakukan pada kecepatan 13.000 rpm selama sepuluh menit pada suhu 4
C. Kecepatan sentrifugasi 13.000 rpm ini setara dengan 27.504 G. Sentrifugasi tahap pertama bertujuan untuk mengendapkan biomassa
dari cairan kultivasi. Endapan yang diperoleh kemudian dibilas dengan aquades untuk pembersihan, kemudian dilakukan sentrifugasi tahap
kedua. Hasil bilasan ditambah NaOCl 0,2 , kemudian dilakukan proses digest selama satu jam untuk menghancurkan materi sel selain
PHA. Proses digest dilakukan di dalam labu erlenmeyer 250 ml yang ditempatkan pada water bath shaker dengan suhu 37
C dan kecepatan putar 120 rpm.
PHA dapat dikeluarkan dari dalam sel dan terpisah dari materi sel setelah proses digest dengan NaOCl. Sentrifugasi tahap ketiga
dilakukan untuk memisahkan hasil digest PHA dari cairannya NaOCl dan materi sel terlarut. Hasil sentrifugasi tahap ketiga kemudian dibilas
dengan metanol. Metanol berguna untuk melarutkan sisa NaOCl dan materi sel lain yang masih tersisa sehingga terpisah dari PHA.
Pemisahan PHA dari metanol dilakukan dengan sentrifugasi tahap keempat. Endapan hasil sentrifugasi keempat diambil dan diletakkan
diatas cawan petri, kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 50 C sampai kering. PHA berbentuk padatan kering setelah pengeringan
dengan oven, namun PHA ini masih mengandung pengotor seperti protein, lemak, dan media kultivasi yang tersisa, sehingga perlu
dimurnikan lebih lanjut. Diagram alir proses hilir PHA dapat dilihat pada Lampiran 4.
Polimer PHA yang telah dikeringkan dan ditumbuk sampai halus dilarutkan ke dalam kloroform dengan perbandingan 1:50 bv.
Campuran tersebut kemudian direfluks pada suhu 50 C dengan
pengadukan menggunakan magnetic stirer selama 20-24 jam. Setelah selesai, campuran kemudian disaring dengan corong Buchner
menggunakan kertas saring Whatman 42. Cairan yang lolos kertas saring kemudian ditampung di atas cawan petri dan pelarut diuapkan
pada suhu ruang. PHA yang didapatkan dari proses ini sudah berbentuk lembaran seperti plastik dan siap digunakan pada penelitian utama.
2. Pembuatan Film Bioplastik Juari, 2006
Pada penelitian ini perlakuan yang diujikan adalah konsentrasi pemlastis PEG 400 yang digunakan. Pembuatan bioplastik dilakukan
dengan 3 konsentrasi pemlastis PEG 400 yaitu 10, 20, dan 30 bb. Bioplastik terbaik ditentukan dengan melihat hasil analisa kuat tarik dan
perpanjangan putusnya. Bioplastik terbaik kemudian dianalisa sifat thermal, derajat kristalinitas, dan analisa gugus fungsinya. Setiap taraf
perlakukan pada penelitian ini dilakukan pengulangan sebanyak dua kali. Diagram alir proses pembuatan bioplastik yang dilakukan pada penelitian
ini dapat dilihat pada Lampiran 5. Proses pembuatan film bioplastik dilakukan dengan cara
pencampuran antara PHA – pelarut kloroform – pemlastis PEG 400. Pencampuran dilakukan dengan melarutkan 0,27 g PHA dengan pelarut
kloroform di dalam botol kecil 20 ml. Larutan PHA-kloroform diaduk selama 1 jam dengan menggunakan magnetic stirer pada suhu 50
C dan menggunakan pendingin tegak. Setelah 1 jam, ke dalam larutan tersebut
dimasukkan PEG 400 dengan konsentrasi tertentu sesuai yang akan diujikan. Larutan PHA-kloroform-PEG 400 diaduk kembali pada kondisi
yang sama selama 0,5 jam. Perbandingan antara PHA dengan PEG 400 dan kloroform yang digunakan adalah 1:35, dengan jumlah PEG 400
tergantung dari persentase pemlastis yang ingin diuji Tabel 3. Contoh cara penghitungan formula bioplastik pada Tabel 3 dapat dilihat pada
Lampiran 6. Setelah pengadukan selesai, larutan dituang ke dalam cetakan kaca 4,5 x 19 cm dan dibiarkan dalam suhu ruang sampai kloroform
menguap semua dan terbentuk lembaran plastik. Tabel 3. Formula bioplastik
Kode PHA g Kloroform
g PEG 400
Total g g
K1 0,270 9,420 10
0,030 9,720 K2
0,270 9,383 20 0,068 9,720
K3 0,270 9,334 30
0,116 9,720
3. Karakterisasi Film Bioplastik
Karakterisasi film bioplastik dilakukan dengan melakukan pengujian beberapa sifat fisik dan mekanis film bioplastik. Pengujian sifat
fisik film bioplastik meliputi pengukuran derajat kristalinitas, gugus fungsi, dan densitas, sedangkan pengujian sifat mekanis dilakukan dengan
mengukur kuat tarik dan perpanjangan putus film bioplastik.
a. Kuat Tarik dan Perpanjangan Putus ASTM D 882-97, 1998
Pengukuran kuat tarik dilakukan di Sentra Teknologi Polimer STP PUSPIPTEK Serpong. Alat yang digunakan adalah Universal
Testing Machine UTM dengan merk Simadzu AGS-10KNG. Metode pengujian mengacu pada ASTM D 882-92. Sampel yang berbentuk
lembaran dipotong dengan panjang 130 mm dan lebar 5 mm. Sampel dikondisikan dalam climatic chamber pada suhu 23
C dan kelembaban 50 selama 48 jam sebelum pengujian. Kondisi ruang uji:
suhu 23,7 C dan kelembaban 60,0. Pengujian dilakukan dengan
kecepatan 120 mmmenit. Kuat tarik plastik tensile strength dapat dihitung dengan persamaan berikut :
τ = F
max
A Keterangan:
τ = kuat tarik MPa
F
max
= tegangan maksimum Kgf A
= luas penampang melintang mm
2
b. Gugus Fungsi Nur, 1989
Gugus fungsi PHB dapat dideteksi menggunakan alat FTIR Fourier Transform Infra-Red Spectroscopy. FTIR adalah alat yang
menggunakan infra merah untuk mengidentifikasi struktur suatu senyawa baik organik maupun anorganik. Analisa gugus fungsi
dilakukan di Departemen Teknik Gas dan Petrokimia Fakultas Teknik Universitas Indonesia. Alat yang digunakan adalah Fourier Transform
Infra-Red Spectroscopy FTIR dengan merk ATI Mattson. Sampel pengujian yang berbetuk lembaran dipotong melingkar dengan
diameter 10 mm, kemudian dimasukkan ke dalam alat FTIR dan di tembak dengan sinar infra merah pada bilangan gelombang 500-4000
cm
-1
. Hasil yang didapatkan berupa spektrum absorbansi sinar infra merah.
c. Sifat Termal ASTM D3418-99, 1998
Analisa sifat thermal polimer dilakukan di Sentra Teknologi Polimer STP kawasan Puspitek Serpong. Alat yang digunakan adalah
Differential Scanning Calorimetry DSC dengan merk Mettler Toledo. Analisa sifat termal meliputi suhu pelelehan melting point, Tm, suhu
transisi kaca glass transition temperature, Tg, dan perubahan entalpi sampel selama proses tersebut. Sampel ditimbang sekitar 20 mg
dimasukkan dalam crucible 40 µl. Analisa dilakukan dengan pemanasan sampel dari suhu -90
C hingga 200 C. Kecepatan
pemanasan adalah 10 Cmenit. Nitrogen cair digunakan untuk
pendinginan dengan kecepatan aliran 50 mlmenit.
d. Derajat Kristalinitas Barham et al. 1984 dan Hahn et al. 1994
Pengukuran derajat kristalinitas dilakukan dengan metode pendekatan. Metode ini didasarkan pada perubahan entalpi yang terjadi
pada saat tercapainya suhu pelelehan yang terukur pada saat pengukuran suhu pelelahan dengan DSC. PHA dengan derajat
kristalinitas 100 akan mempunyai perubahan entalpi sebesar 146 Jg. Dengan melakukan perbandingan perubahan entalpi sampel uji dan
PHA dengan kristalinitas 100 maka akan dapat diketahui derajat kristalinitas sampel uji.
Kristalinitas PHB sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
Xc = ΔHf ΔHo x 100
Keterangan: Xc = kristalinitas ,
ΔHf = entalpi pelelehan sampel Jg, ΔHo = entalpi pelelehan PHB 100 kristalin 146 Jg
e. Densitas Rabek, 1983
Penentuan densitas dilakukan dengan cara menghitung massa dan volume sampel. Nilai densitas diperoleh dengan cara membagi
nilai massa terhadap volume. Sampel dibentuk segi empat, kemudian diukur panjang, lebar, dan tebalnya. Ketebalan sampel diukur dengan
menggunakan mikrometer sekrup pada 5 titik yang berbeda dan dihitung rata-ratanya.
Г = V
m
Keterangan: Г = densitas gcm
3
m = massa bahan g V = volume bahan cm
3
C. ANALISA DATA
Analisa data yang digunakan adalah statistika deskriptif. Statistika deskriptif adalah metode-metode yang berkaitan dengan pengumpulan dan
penyajian suatu gugus data sehingga memberikan informasi yang berguna. Penyusunan tabel, diagram, grafik, dan besaran-besaran lain termasuk ke
dalam kategori statistika deskriptif ini Sudjana 1994 dan Walpole 1995.
D. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Kategori