Spektrofotometri UV-Visible Alat Bahan Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Jeruk Kesturi, Lemon, Purut, dan

Kerangka flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.2 berikut: Gambar 2.2 Kerangka flavonoid Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran dari flavonoid yang berbeda golongan dan jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal. Flavonoid pada tumbuhan terdapat dalam berbagai bentuk struktur molekul dengan beberapa bentuk kombinasi glikosida. Untuk menganalisis flavonoid lebih baik memeriksa aglikon yang telah terhidrolisis daripada dalam bentuk glikosida dengan strukturnya yang rumit dan kompleks. Flavonoid dapat berkhasiat sebagai antioksidan, antibakteri dan antiinflamasi Harborne, 1984. Struktur dasar dan sistem penomoran untuk turunan flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.3 berikut: Gambar 2.3 Struktur dasar flavonoid

2.5 Spektrofotometri UV-Visible

Spektrofotometer pada dasarnya terdiri dari sumber sinar, monokromator, sel untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan alat ukur atau pencatat. Spektrofotometri serapan merupakan metode pengukuran serapan radiasi Universitas Sumatera Utara elektromagnetik pada panjang gelombang tertentu, yang diserap zat Depkes RI, 1979. Berdasarkan panjang gelombang spektrofotometri dibagi dua yaitu spektrofotometri ultraviolet dengan panjang gelombang 200-400 nm, digunakan untuk senyawa yang tidak berwarna dan spektrofotometri visibel sinar tampak dengan panjang gelombang 400-750 nm, digunakan untuk senyawa yang berwarna Rohman, 2007.

2.6 Metode Pemerangkapan Radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil DPPH pertama kali ditemukan pada tahun 1922 oleh Goldschmidt dan Renn. DPPH berwarna ungu pekat seperti KMnO4, bersifat tidak larut dalam air Ionita, 2005. Struktur kimia radikal bebas DPPH dapat dilihat pada Gambar 2.4 berikut ini: Gambar 2.4 Struktur kimia radikal bebas DPPH Metode pemerangkapan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH adalah suatu metode sederhana yang dapat digunakan untuk menguji kemampuan antioksidan yang terkandung dalam makanan. Metode ini dapat digunakan untuk sampel yang padat dan bentuk larutan. Prinsipnya adalah elektron ganjil pada Universitas Sumatera Utara molekul DPPH memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang tertentu, berwarna ungu. Warna akan berubah dari ungu menjadi kuning lemah apabila elektron ganjil tersebut berpasangan dengan atom hidrogen yang disumbangkan senyawa antioksidan. Perubahan warna ini berdasarkan reaksi kesetimbangan kimia Prakash, 2001. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil karena resonansi yang dialaminya. Resonansi juga menyebabkan peningkatan kepekatan warna ungu Molyneux, 2004. Resonansi DPPH dapat dilihat pada Gambar 2.5 berikut ini: Gambar 2.5 Resonansi DPPH Ketika larutan DPPH dicampurkan dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, akan dihasilkan bentuk tereduksi dari DPPH dan berkurangnya warna ungu Molyneux, 2004. Reaksi antara DPPH dengan atom H dari senyawa antioksidan dapat dilihat pada Gambar 2.6 berikut: Universitas Sumatera Utara Gambar 2.6 Reaksi antara DPPH dengan atom H dari senyawa antioksidan

2.6.1 Pelarut

Metode pemerangkapan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH akan memberi hasil yang baik dengan menggunakan pelarut metanol atau etanol dan kedua pelarut ini tidak mempengaruhi dalam reaksi antara sampel uji sebagai antioksidan dengan DPPH sebagai radikal bebas Molyneux, 2004.

2.6.2 Pengukuran absorbansi – panjang gelombang

Panjang gelombang maksimum λ maks yang digunakan dalam pengukuran sampel uji sangat bervariasi. Menurut beberapa literatur panjang gelombang maksimum untuk DPPH antara lain 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, 519 nm dan 520 nm. Apabila pengukuran menghasilkan tinggi puncak maksimum, maka itulah panjang gelombangnya yaitu sekitar panjang gelombang yang disebutkan di atas. Nilai absorbansi yang mutlak tidaklah penting, karena panjang gelombang dapat diatur untuk memberikan absorbansi maksimum sesuai dengan alat yang digunakan Molyneux, 2004.

2.6.3 Waktu pengukuran

Lamanya pengukuran menurut beberapa literatur yang direkomendasikan adalah selama 60 menit, tetapi dalam beberapa penelitian waktu yang digunakan Universitas Sumatera Utara sangat bervariasi yaitu 5 menit, 10 menit, 20 menit, 30 menit dan 60 menit. Waktu reaksi yang tepat adalah ketika reaksi sudah mencapai kesetimbangan. Kecepatan reaksi dipengaruhi oleh sifat dari aktivitas antioksidan yang terdapat di dalam sampel Molyneux, 2004; Rosidah, et al., 2008. Universitas Sumatera Utara

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan dan penyiapan bahan, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol kulit buah jeruk, pengujian aktivitas antioksidan kulit buah jeruk dan vitamin C dengan metode peredaman radikal bebas DPPH dengan menggunakan alat spektrofotometer visible.

3.1 Alat

Alat-alat yang digunakan terdiri dari alat-alat gelas laboratorium, spektrofotometer UV-Visible Shimadzu 1800, rotary evaporator Heidolph VV 2000, oven listrik Strok, neraca kasar Ohaus, neraca analitis Vibra, blender National, penangas air Yenaco, seperangkat alat penetapan kadar air, desikator, cawan porselin, mikroskop, object glass, gelas penutup, lemari pengering, krus tang dan pisau.

3.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, bali dan air suling. Bahan-bahan kimia lainnya yang berkualitas pro analisis adalah DPPH Sigma, vitamin C CSPC Weisheng PharmaceuticalShijiazhuang, produksi E-Merck: metanol, toluen, kloroform, isopropanol, benzen, n-heksan, asam nitrat pekat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, raksa II klorida, bismut III nitrat, besi III klorida, timbal II asetat, Universitas Sumatera Utara kalium iodida, kloralhidrat, asam asetat anhidrida, natrium hidroksida, amil alkohol, natrium sulfat anhidrat, serbuk magnesium. Bahan kimia berkualitas teknis; etanol 96.

3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan

Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengambilan bahan kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali., identifikasi kulit buah jeruk, dan pembuatan simplisia kulit buah jeruk.

3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan

Metode pengumpulan bahan kulit buah jeruk dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan bahan kulit buah jeruk yang sama dari daerah lain. Bahan yang digunakan adalah kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali yang diperoleh dari Supermarket Brastagi, Jln. Gatot Subroto, Medan.

3.3.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor.

3.3.3 Pembuatan simplisia

Buah jeruk kesturi, jeruk lemon, jeruk purut, dan jeruk bali dikumpulkan, dicuci, dikupas kulitnya, lalu ditiriskan. Bagian kulit yang diambil yaitu mulai dari bagian kulit terluar sampai dengan bagian kulit dalam yang berbatasan dengan buah. Kemudian kulit ditimbang sebagai berat basah. Bahan ini kemudian dikeringkan di lemari pengering hingga kering, yaitu ketika simplisia tersebut diremas akan hancur, kemudian ditimbang sebagai berat kering. Simplisia kemudian disimpan pada wadah yang terlindung dari sinar matahari. Universitas Sumatera Utara 3.4. Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Bouchardat Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.2 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml, pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.3 Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida, dilarutkan dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan air suling hingga volume larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.4 Pereaksi Molish

Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.5 Pereaksi asam klorida 2 N

Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.4.6 Pereaksi asam sulfat 2 N

Sebanyak 5,4 ml larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.7 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.8 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.9 Pereaksi besi III klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.10 Pereaksi kloralhidrat

Sebanyak 8 gram kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling Depkes RI, 1995.

3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrida dicampur dengan 1 bagian asam sulfat pekat. Larutan pereaksi ini harus dibuat baru Harborne, 1984.

3.4.12 Larutan DPPH 0,5 mM

Sebanyak 19,7 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dalam metanol hingga diperoleh volume larutan 100 ml. Universitas Sumatera Utara 3.5 Pemeriksaan Makroskopik dan Mikroskopik Kulit Buah Jeruk Segar 3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan memperhatikan bentuk, ukuran, bau, rasa dan warna kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali.

3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik jaringan segar dilakukan sebagai acuan terhadap fragmen-fragmen yang terdapat pada simplisia kulit buah jeruk. Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap penampang melintang jaringan segar dari kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali dengan cara, 2-3 tetes larutan kloralhidrat diteteskan di atas kaca objek lalu sayatan jaringan segar diletakkan diatasnya, kemudian ditutup dengan kaca penutup, lalu diamati di bawah mikroskop.

3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.

3.6.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan memperhatikan bentuk, ukuran, bau, rasa dan warna simplisia kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali. Universitas Sumatera Utara

3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap simplisia kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali dengan cara, 2-3 tetes larutan kloralhidrat diteteskan di atas kaca objek lalu serbuk simplisia diletakkan diatasnya, kemudian ditutup dengan kaca penutup, lalu diamati di bawah mikroskop.

3.6.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung dan pendingin, tabung penyambung dan penerima 10 ml. Cara kerja:

a. Penjenuhan toluen

Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. b. Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluen jenuh tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua Universitas Sumatera Utara volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen vb WHO, 1998.

3.6.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 95 menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai Universitas Sumatera Utara diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.7 Skrining Fitokimia

Skirining fitokimia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloida, glikosida, flavonoid, steroidtriterpenoid, saponin, tannin dan antrakinon.

3.7.1 Pemeriksaan alkaloid

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring, filtrat dipakai untuk uji alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada tabung I : ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning Pada tabung II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan. Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman Universitas Sumatera Utara Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau tiga dari percobaan di atas Depkes RI, 1995.

3.7.2 Pemeriksaan glikosida

Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95 dengan 3 bagian air suling 7:3 dan 10 ml asam klorida 2N. Kemudiaan direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan kemudiaan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 C, sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut, 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish, lalu ditambahkan dengan perlahan-lahan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon atau glikosida Depkes RI, 1995.

3.7.3 Pemeriksaan steroidtriterpenoid

Sebanyak 1 g serbuk simplisia ditimbang, dimaserasi dengan 20 ml n- heksan selama 2 jam, disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman-Burchard, timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Harborne, 1984. Universitas Sumatera Utara

3.7.4 Pemeriksaan flavonoid

Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditimbang, dilarutkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.7.5 Pemeriksaaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes RI, 1995.

3.7.6 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat- kuat selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang Depkes RI, 1995.

3.7.7 Pemeriksaan antrakinon

Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditimbang, dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring, kemudian kocok dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzene tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.8 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Jeruk Kesturi, Lemon, Purut, dan

Bali Pembuatan ekstrak etanol kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali dilakukan dengan cara maserasi. Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 150 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituangi dengan 1125 ml etanol 96, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk. Setelah 5 hari campuran tersebut diserkai. Ampas dicuci dengan etanol 96 secukupnya sehingga diperoleh 1500 ml maserat. Pindahkan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari kemudian di enaptuang. Maserat diuapkan dengan bantuan alat penguap vakum putar sampai diperoleh ekstrak kental kemudian ekstrak dikeringkan dengan freeze dryer Depkes RI, 1979. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 69.