BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan dan penyiapan bahan, karakterisasi simplisia,
skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol kulit buah jeruk, pengujian aktivitas antioksidan kulit buah jeruk dan vitamin C dengan metode peredaman radikal
bebas DPPH dengan menggunakan alat spektrofotometer visible.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari alat-alat gelas laboratorium, spektrofotometer UV-Visible Shimadzu 1800, rotary evaporator Heidolph VV
2000, oven listrik Strok, neraca kasar Ohaus, neraca analitis Vibra, blender National, penangas air Yenaco, seperangkat alat penetapan kadar air,
desikator, cawan porselin, mikroskop, object glass, gelas penutup, lemari pengering, krus tang dan pisau.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, bali dan air suling. Bahan-bahan kimia lainnya yang berkualitas pro
analisis adalah DPPH Sigma, vitamin C
CSPC Weisheng PharmaceuticalShijiazhuang, produksi E-Merck: metanol, toluen, kloroform,
isopropanol, benzen, n-heksan, asam nitrat pekat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, raksa II klorida, bismut III nitrat, besi III klorida, timbal II asetat,
Universitas Sumatera Utara
kalium iodida, kloralhidrat, asam asetat anhidrida, natrium hidroksida, amil alkohol, natrium sulfat anhidrat, serbuk magnesium. Bahan kimia berkualitas
teknis; etanol 96.
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengambilan bahan kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali., identifikasi kulit buah jeruk, dan pembuatan
simplisia kulit buah jeruk.
3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Metode pengumpulan bahan kulit buah jeruk dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan bahan kulit buah jeruk yang sama dari daerah
lain. Bahan yang digunakan adalah kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali yang diperoleh dari Supermarket Brastagi, Jln. Gatot Subroto, Medan.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor.
3.3.3 Pembuatan simplisia
Buah jeruk kesturi, jeruk lemon, jeruk purut, dan jeruk bali dikumpulkan, dicuci, dikupas kulitnya, lalu ditiriskan. Bagian kulit yang diambil yaitu mulai
dari bagian kulit terluar sampai dengan bagian kulit dalam yang berbatasan dengan buah. Kemudian kulit ditimbang sebagai berat basah. Bahan ini kemudian
dikeringkan di lemari pengering hingga kering, yaitu ketika simplisia tersebut diremas akan hancur, kemudian ditimbang sebagai berat kering. Simplisia
kemudian disimpan pada wadah yang terlindung dari sinar matahari.
Universitas Sumatera Utara
3.4. Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.2 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml, pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10
ml air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.3 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida, dilarutkan
dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan
air suling hingga volume larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.4 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.5 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.4.6 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,4 ml larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.7 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.8 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.9 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.10 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 8 gram kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling Depkes RI, 1995.
3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrida dicampur dengan 1 bagian asam sulfat pekat. Larutan pereaksi ini harus dibuat baru Harborne, 1984.
3.4.12 Larutan DPPH 0,5 mM
Sebanyak 19,7 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dalam metanol hingga diperoleh volume larutan 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Pemeriksaan Makroskopik dan Mikroskopik Kulit Buah Jeruk Segar 3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan memperhatikan bentuk, ukuran, bau, rasa dan warna kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali.
3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik jaringan segar dilakukan sebagai acuan terhadap fragmen-fragmen yang terdapat pada simplisia kulit buah jeruk. Pemeriksaan
mikroskopik dilakukan terhadap penampang melintang jaringan segar dari kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali dengan cara, 2-3 tetes larutan
kloralhidrat diteteskan di atas kaca objek lalu sayatan jaringan segar diletakkan diatasnya, kemudian ditutup dengan kaca penutup, lalu diamati di bawah
mikroskop.
3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut
dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.
3.6.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan memperhatikan bentuk, ukuran, bau, rasa dan warna simplisia kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan
bali.
Universitas Sumatera Utara
3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap simplisia kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali dengan cara, 2-3 tetes larutan kloralhidrat
diteteskan di atas kaca objek lalu serbuk simplisia diletakkan diatasnya, kemudian ditutup dengan kaca penutup, lalu diamati di bawah mikroskop.
3.6.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung dan pendingin, tabung penyambung dan
penerima 10 ml. Cara kerja:
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
b. Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan
ke dalam labu yang berisi toluen jenuh tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap
detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam
pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen
memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua
Universitas Sumatera Utara
volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen vb WHO, 1998.
3.6.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter
menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan
sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air
dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.6.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 95 menggunakan labu bersumbat sambil sesekali dikocok
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang
telah ditara dan dipanaskan pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan
Depkes RI, 1995.
3.6.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600
o
C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai
Universitas Sumatera Utara
diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.6.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.7 Skrining Fitokimia
Skirining fitokimia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloida, glikosida, flavonoid, steroidtriterpenoid, saponin, tannin dan antrakinon.
3.7.1 Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan
dan disaring, filtrat dipakai untuk uji alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke
dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 ml filtrat.
Pada tabung I : ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning
Pada tabung II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan.
Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman
Universitas Sumatera Utara
Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau tiga dari percobaan di atas Depkes RI, 1995.
3.7.2 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95 dengan 3 bagian air suling 7:3 dan 10 ml asam klorida
2N. Kemudiaan direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M dikocok,
didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan
kemudiaan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 C, sisanya dilarutkan
dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut, 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas
penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish, lalu ditambahkan dengan perlahan-lahan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding
tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon atau glikosida Depkes RI, 1995.
3.7.3 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia ditimbang, dimaserasi dengan 20 ml n- heksan selama 2 jam, disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada
sisa ditambahkan 20 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman-Burchard, timbulnya warna biru atau biru hijau
menunjukkan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Harborne, 1984.
Universitas Sumatera Utara
3.7.4 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditimbang, dilarutkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml
filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.7.5 Pemeriksaaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan
diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes
RI, 1995.
3.7.6 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-
kuat selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam
klorida 2 N buih tidak hilang Depkes RI, 1995.
3.7.7 Pemeriksaan antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditimbang, dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen,
dikocok dan didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring, kemudian kocok dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan
benzene tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.8 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Jeruk Kesturi, Lemon, Purut, dan
Bali
Pembuatan ekstrak etanol kulit buah jeruk kesturi, lemon, purut, dan bali dilakukan dengan cara maserasi. Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 150 g
serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana tertutup, dituangi dengan 1125 ml etanol 96, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering
diaduk. Setelah 5 hari campuran tersebut diserkai. Ampas dicuci dengan etanol 96 secukupnya sehingga diperoleh 1500 ml maserat. Pindahkan dalam bejana
tertutup dan dibiarkan di tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari kemudian di enaptuang. Maserat diuapkan dengan bantuan alat penguap vakum
putar sampai diperoleh ekstrak kental kemudian ekstrak dikeringkan dengan freeze dryer Depkes RI, 1979. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 5,
halaman 69.
3.9 Pengujian Kemampuan Antioksidan dengan Spektrofotometer UV- visible