Bahan dan Peralatan Analisis serum darah tikus.

11

BAB 4. METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan dalam dua tahapan penelitian. Secara garis besar tahapan penelitian yang dilaksanakan dapat dilihat pada Gambar 1. Mengacu pada penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa campuran kedelai dan rumput laut memiliki sifat hipoglikemik pada hewan coba yang diinduksi diabetes, maka penelitian ini dilanjutkan dengan penelitian tahap II yaitu pengujian sifat hipokolesterolemikcampuran kedelai dan rumput laut pada hewan coba diabetes hiperkolesterolemik.

3.1. Bahan dan Peralatan

Bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu rumput laut jenis E. cottoni dan kedelai varietas lokal. Bahan lain yang digunakan yaitu pakan tikus yang mengacu pada standar yang telah ditetapkan oleh American Institut of Nutrition AIN, 1993. Bahan untuk pakan tikus meliputi pati jagung, CMC, minyak kedelai, sukrosa, kasein Sigma, AS, campuran vitamin dan campuran mineral ICN Biomedical, Inc. Aurora, Ohio, Amerika. Reagen kimia yang digunakan untuk analisis yaitu NaOH, H 2 SO 4 , asam borat, HgO, Na 2 SO 4 , HCl pekat, alloxan monohidrat Sigma, glukosa kit dan hexan Sigma. Peralatan yang digunakan untuk penelitian diantaranya homogenizer, vortex, sentrifugasi kecil Hettich EBA III, satu unit alat untuk analisis protein, satu unit alat untuk analisis lemak, grinder, blender Philips, kandang tikus dan perlengkapannya, muffle Pengujian sifat hipokoleserolemik secara bioassay Gambar 1. Diagram Alir Penelitian Rumput laut, kedelai dan Konsentrat Protein Kedelai Analisis proksimat Pengujian sifat hipoglikemik secara bioassay Penelitian Tahap I Penelitian Tahap II Analisis proksimat Análisis gula darah, HDL, LDL, total kolesterol, trigliserida darah Análisis gula darah, gula urin, konsumsi pakan, berat badan 12 furnance Heraeus Instrument, oven, kabinet dryer, timbangan kasar Sartorius, neraca analitik Sartorius, syringe injeksi, micro-hematokrite tube Becton Dickinson Company, mikro pipet, Kit Glucoce GOD FS , Kit Cholesterol FS , Kit Triglycerides FS dan HDL Precipitant. 3.2. Pelaksanaan penelitian 3.2.1. Pembuatan tepung kedelai dan tepung rumput laut. Sebelum pelaksanaan bioassay, dilakukan persiapan berupa pembuatan tepung kedelai dan tepung rumput laut. Tepung kedelai dibuat dengan cara sebagai berikut : kedelai setelah disortir dilakukan pencucian selanjutnya dikeringkan sampai diperoleh kadar air kira kira 10 . Kedelai yang telah kering digiling atau ditepungkan dan diayak dengan ayakan 60 mesh. Tepung rumput laut dibuat dengan cara merendam terlebih dahulu rumput laut dalam air tawar selama 9 jam dan dilanjutkan dengan perendaman dalamlarutan NaOCl 1 selama 30 menit, selanjutnya dilakukan pengecilan ukuran dan dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari. Rumput laut yang telah kering digiling dan diayak dengan ayakan 32 mesh Herpandi et al., 2006.

3.2.2. Pembuatan pakan standar dan pakan perlakuan.

Pakan standar dibuat dengan cara mencampurkan bahan bahan yang mengacu pada pembuatan pakan standar menurut AIN 1993 Reeves et al., 1993. Komposisi bahan untuk pakan standar dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Komposisi pakan standar. Bahan Pakan standar g kg Pati jagung Kasein Sukrosa Minyak kedelai CMC Campuran mineral Campuran vitamin L-sistin Kolin bitrartrat Total 620,69 140. 100 40 50 35 10 1,8 2,5 999,99 Sumber : Reeves et al., 1993 13 Pakan perlakuan kedelaidibuat dengan cara mengganti sumber protein kasein pada pakan standar dengan protein kedelaidengan pertimbangan isokalori dan iso nitrogen, sedangkan pakan perlakuanrumput laut dibuat dengan cara menambahkan tepung rumput laut sebanyak 10 ke dalam pakan standar. Pakan perlakuan campuran kedelai dan rumput laut dibuat dengan cara mengganti sumber protein kasein pada pakan standar dengan protein kedelai dan menambahkan 10 tepung rumput laut. Pakan hiperkolesterol dibuat dengan cara menambahkan 10 lemak sapi dan 2 kuning telor bebek pada pakan standar. Cara pembuatan pakan standar yaitu bahan bahan selain vitamin, mineral, kholin bitartrat dan L-sistin dicampur terlebih dahulu dan diperoleh Campuran 1. Sementara vitamin, mineral, kholin bitartrat dan L-sistin dicampur secara terpisah Campuran 2. Setelah diperoleh dua macam campuran maka Campuran 2 dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam Campuran 1 sambil diaduk hingga rata. Adonan selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin pencetak hingga diperoleh pakan standar berbentuk silinder panjang.Pakan standar yang telah dicetak selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 50 o C selama 8 jam.

3.3.3. Bioassay

Pada pengujian bioassay digunakan tikus Wistar jantan berumur ± 3 bulan dengan berat 100 200 g, sebanyak 30 ekor.Tikus ditempatkan pada kandang individual dan diadaptasikan dengan pakan standar selama seminggu, setelah itu diberi pakan hiperkolesterol kecuali kelompok placebo. Tikus hiperkolesterol selanjutnya diinjeksi alloxan 100 mgkg bb dan dibagi menjadi 4 kelompok. Masing-masing kelompok diberi pakan perlakuan yang berbeda. Prosedur bioassay dapat dilihat pada Gambar 2. 14 Pengujian dilakukan selama 30 hari. Pengamatan konsumsi pakan dilaksanakan setiap hari. Penimbangan berat badan, pengamatan gula darah, HDL, LDL , total kolesterol dan trigliserida serumdilakukan 1 hari setelah injeksi alloxan selanjutnya dilakukan pada hari ke 0, 1 dan 30 setelah injeksi alloxan.Selama pengujian, kandang tikus dibersihkan setiap hari, pakan dan minumnya diganti. PS - APS Keterangan : PS : Pakan Standar Negatif Positif PK : Pakan Kedelai PRL : Pakan Rumput Laut PKRL : Pakan Kedelai Rumput Laut Gambar 2. Prosedur Bioassay Adaptasi 1 minggu Tikus Dipuasakan semalam, Análisis gula darah, HDL, LDL, total kolesterol dan trigliserida serum Kontrol placebo Analisis Hari ke 0,1, dan 30 Análisis gula darah, HDL, LDL, total kolesterol dan trigliserida serum. Kelompok hiperkolesterol Pakan standar standar Análisis gula darah, HDL, LDL, total kolesterol dan trigliserida serum Dipuasakan semalam, Injeksi alloxan Tanpa injeksi alloxan PS + PK PKRL APS APS PRL 15

3.3.4. Rancangan Percobaan

Rancangan Percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari 5 perlakuan yaitu : 1. Tanpa injeksi alloxan pakan standar[PS -] 2. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan standar[PS +] 3. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan tepung kedelai[PK] 4. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan tepung rumput [PRL] 5. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan tepung kedelai dan rumput laut[PKRL] Pengamatan dan análisis dilakukan secara berulang dari hari ke 0, 1, dan 30. Disamping itu dilakukan pula análisis proksimat pada bahanpakan. Hasil yang telah diperoleh selanjutnya dilakukan analisis statistik. Adanya beda nyata dari masing masing perlakuan dilanjutkan dengan uji DMRT Duncans Multiple Range Test Gomes Gomes, 1995.

3.3.5. Pengamatan a. Analisis proksimat

Analisis proksimat dilakukan terhadaptepung kedelai dantepung rumput laut yang meliputi kadar air dengancara pemanasan oven AOAC, 1990, kadar abu dengan pemijaran dalam muffle AOAC, 1990, kadar protein dengan cara semi mikro kjeldahl AOAC, 1990, lemak dengan metode soxhlet AOAC, 1990 dan kadar karbohidrat dengan carbohydrate by difference.

b. Analisis serum darah tikus.

Darah tikus diambil secara reorbital flexus. Gula darah ditentukan dengan metode GOD-PAP. Prinsip dari metode ini yaitu glukosa dioksidasi oleh enzim glukosa oksidase menghasilkan asam glukonat dan H 2 O 2 . Selanjutnya H 2 O 2 direaksikan dengan amynophenasone dan phenol dengan bantuan enzim peroksidase menghasilkan quinoneimine. Warna yang dihasilkan dibaca absorbansinya, kemudian dihitung konsentrasi glukosanya

c. Analisis Profil Lipid