11
BAB 4. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan dalam dua tahapan penelitian. Secara garis besar tahapan penelitian yang dilaksanakan dapat dilihat pada Gambar 1.
Mengacu pada penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa campuran kedelai dan rumput laut memiliki sifat hipoglikemik pada hewan coba yang diinduksi diabetes, maka
penelitian ini dilanjutkan dengan penelitian tahap II yaitu pengujian sifat hipokolesterolemikcampuran kedelai dan rumput laut pada hewan coba diabetes
hiperkolesterolemik.
3.1. Bahan dan Peralatan
Bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu rumput laut jenis E. cottoni dan kedelai varietas lokal. Bahan lain yang digunakan yaitu pakan tikus yang mengacu pada
standar yang telah ditetapkan oleh American Institut of Nutrition AIN, 1993. Bahan untuk pakan tikus meliputi pati jagung, CMC, minyak kedelai, sukrosa, kasein Sigma, AS,
campuran vitamin dan campuran mineral ICN Biomedical, Inc. Aurora, Ohio, Amerika. Reagen kimia yang digunakan untuk analisis yaitu NaOH, H
2
SO
4
, asam borat, HgO, Na
2
SO
4
, HCl pekat, alloxan monohidrat Sigma, glukosa kit dan hexan Sigma.
Peralatan yang digunakan untuk penelitian diantaranya homogenizer, vortex, sentrifugasi kecil Hettich EBA III, satu unit alat untuk analisis protein, satu unit alat untuk
analisis lemak, grinder, blender Philips, kandang tikus dan perlengkapannya, muffle
Pengujian sifat hipokoleserolemik secara bioassay
Gambar 1. Diagram Alir Penelitian
Rumput laut, kedelai dan Konsentrat Protein Kedelai
Analisis proksimat Pengujian sifat hipoglikemik
secara bioassay
Penelitian Tahap I Penelitian Tahap II
Analisis proksimat
Análisis gula darah, HDL, LDL, total kolesterol, trigliserida darah
Análisis gula darah, gula urin, konsumsi pakan, berat badan
12 furnance Heraeus Instrument, oven, kabinet dryer, timbangan kasar Sartorius, neraca
analitik Sartorius, syringe injeksi, micro-hematokrite tube Becton Dickinson Company, mikro pipet, Kit Glucoce GOD FS , Kit Cholesterol FS , Kit Triglycerides FS dan HDL
Precipitant.
3.2. Pelaksanaan penelitian 3.2.1. Pembuatan tepung kedelai dan tepung rumput laut.
Sebelum pelaksanaan bioassay, dilakukan persiapan berupa pembuatan tepung kedelai dan tepung rumput laut. Tepung kedelai dibuat dengan cara sebagai berikut : kedelai
setelah disortir dilakukan pencucian selanjutnya dikeringkan sampai diperoleh kadar air kira kira 10 . Kedelai yang telah kering digiling atau ditepungkan dan diayak dengan ayakan 60
mesh.
Tepung rumput laut dibuat dengan cara merendam terlebih dahulu rumput laut dalam air tawar selama 9 jam dan dilanjutkan dengan perendaman dalamlarutan NaOCl 1
selama 30 menit, selanjutnya dilakukan pengecilan ukuran dan dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari. Rumput laut yang telah kering digiling dan diayak dengan
ayakan 32 mesh Herpandi et al., 2006.
3.2.2. Pembuatan pakan standar dan pakan perlakuan.
Pakan standar dibuat dengan cara mencampurkan bahan bahan yang mengacu pada pembuatan pakan standar menurut AIN 1993 Reeves et al., 1993. Komposisi bahan untuk
pakan standar dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi pakan standar. Bahan
Pakan standar g kg
Pati jagung Kasein
Sukrosa Minyak kedelai
CMC Campuran mineral
Campuran vitamin L-sistin
Kolin bitrartrat Total
620,69 140.
100 40
50 35
10 1,8
2,5 999,99
Sumber : Reeves et al., 1993
13 Pakan perlakuan kedelaidibuat dengan cara mengganti sumber protein kasein pada
pakan standar dengan protein kedelaidengan pertimbangan isokalori dan iso nitrogen, sedangkan pakan perlakuanrumput laut dibuat dengan cara menambahkan tepung rumput laut
sebanyak 10 ke dalam pakan standar. Pakan perlakuan campuran kedelai dan rumput laut dibuat dengan cara mengganti sumber protein kasein pada pakan standar dengan protein
kedelai dan menambahkan 10 tepung rumput laut. Pakan hiperkolesterol dibuat dengan cara menambahkan 10 lemak sapi dan 2 kuning telor bebek pada pakan standar.
Cara pembuatan pakan standar yaitu bahan bahan selain vitamin, mineral, kholin bitartrat dan L-sistin dicampur terlebih dahulu dan diperoleh Campuran 1. Sementara
vitamin, mineral, kholin bitartrat dan L-sistin dicampur secara terpisah Campuran 2. Setelah diperoleh dua macam campuran maka Campuran 2 dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam
Campuran 1 sambil diaduk hingga rata. Adonan selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin pencetak hingga diperoleh pakan standar berbentuk silinder panjang.Pakan standar yang telah
dicetak selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 50
o
C selama 8 jam.
3.3.3. Bioassay
Pada pengujian bioassay digunakan tikus Wistar jantan berumur ± 3 bulan dengan berat 100
200 g, sebanyak 30 ekor.Tikus ditempatkan pada kandang individual dan diadaptasikan dengan pakan standar selama seminggu, setelah itu diberi pakan
hiperkolesterol kecuali kelompok placebo. Tikus hiperkolesterol selanjutnya diinjeksi alloxan 100 mgkg bb dan dibagi menjadi 4 kelompok. Masing-masing kelompok diberi
pakan perlakuan yang berbeda. Prosedur bioassay dapat dilihat pada Gambar 2.
14 Pengujian dilakukan selama 30 hari. Pengamatan konsumsi pakan dilaksanakan
setiap hari. Penimbangan berat badan, pengamatan gula darah,
HDL, LDL
, total kolesterol dan trigliserida serumdilakukan 1 hari setelah injeksi alloxan selanjutnya dilakukan pada hari ke
0, 1 dan 30 setelah injeksi alloxan.Selama pengujian, kandang tikus dibersihkan setiap hari, pakan dan minumnya diganti.
PS -
APS
Keterangan : PS : Pakan Standar Negatif Positif
PK : Pakan Kedelai PRL : Pakan Rumput Laut
PKRL : Pakan Kedelai Rumput Laut Gambar 2. Prosedur Bioassay
Adaptasi 1 minggu Tikus
Dipuasakan semalam,
Análisis gula darah, HDL, LDL, total kolesterol dan trigliserida
serum
Kontrol placebo
Analisis Hari ke 0,1, dan 30
Análisis gula darah, HDL,
LDL, total
kolesterol dan
trigliserida serum.
Kelompok hiperkolesterol Pakan
standar standar
Análisis gula darah, HDL, LDL, total kolesterol dan trigliserida
serum
Dipuasakan semalam,
Injeksi alloxan Tanpa injeksi
alloxan
PS + PK
PKRL
APS
APS
PRL
15
3.3.4. Rancangan Percobaan
Rancangan Percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari 5 perlakuan yaitu :
1. Tanpa injeksi alloxan pakan standar[PS -] 2. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan standar[PS +]
3. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan tepung kedelai[PK] 4. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan tepung rumput [PRL]
5. Hiperkolesterol injeksi alloxan pakan tepung kedelai dan rumput laut[PKRL]
Pengamatan dan análisis dilakukan secara berulang dari hari ke 0, 1, dan 30. Disamping itu dilakukan pula análisis proksimat pada bahanpakan. Hasil yang telah diperoleh selanjutnya
dilakukan analisis statistik. Adanya beda nyata dari masing masing perlakuan dilanjutkan dengan uji DMRT Duncans Multiple Range Test Gomes Gomes, 1995.
3.3.5. Pengamatan a. Analisis proksimat
Analisis proksimat dilakukan terhadaptepung kedelai dantepung rumput laut yang meliputi kadar air dengancara pemanasan oven AOAC, 1990, kadar abu dengan pemijaran
dalam muffle AOAC, 1990, kadar protein dengan cara semi mikro kjeldahl AOAC, 1990, lemak dengan metode soxhlet AOAC, 1990 dan kadar karbohidrat dengan carbohydrate by
difference.
b. Analisis serum darah tikus.
Darah tikus diambil secara reorbital flexus. Gula darah ditentukan dengan metode GOD-PAP. Prinsip dari metode ini yaitu glukosa dioksidasi oleh enzim glukosa oksidase
menghasilkan asam glukonat dan H
2
O
2
. Selanjutnya H
2
O
2
direaksikan dengan amynophenasone dan phenol dengan bantuan enzim peroksidase menghasilkan
quinoneimine. Warna yang dihasilkan dibaca absorbansinya, kemudian dihitung konsentrasi glukosanya
c. Analisis Profil Lipid