Definisi Operasional TINJAUAN PUSTAKA

dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri morfologi yang ada pada tanaman sirih terhadap kepustakaan dan dibuktikan di bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor. 3.8.1.3 Pembuatan Ekstrak Daun Sirih Hijau Metode yang digunakan dalam mengekstrak daun sirih hijau Piper betle L. adalah metode maserasi. Didalam metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96. Sebanyak 500 g daun sirih hijau terlebih dahulu dicuci bersih, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 40°C sampai kering, kemudian diremas dan dihaluskan sampai menjadi serbuk. Serbuk kemudian direndam dalam 3 liter pelarut etanol 96 selama 3x24 jam dan diambil filtratnya dengan penyaringan. Maserasi dilakukan dengan pengadukan sebanyak 12 kali selama 15 menit dengan tenggang waktu 5 menit antar pengadukan, selanjutnya dilakukan penyaringan dengan corong dan kertas saring untuk memisahkan filtrat dari ampas. Hasil saringan kemudian diuapkan pelarutnya dengan menggunakan rotary vacuum evaporator, sehingga didapatkan 16.5 g ekstrak kental yang bebas dari pelarut. Ekstrak yang dihasilkan digunakan untuk pengujian selanjutnya. 3.8.1.4. Pembuatan Stok Variabel Konsentrasi Stok konsentrasi ekstrak daun sirih hijau divariasikan dengan menggunakan pelarut etanol yaitu dimulai dari kontrol negatif berupa etanol, 10 6 , 5x10 6 , dan 10 7 ppm yang terdiri dari ekstrak daun sirih hijau saja serta kontrol positif menggunakan antibiotika amoksilin yang tepat bagi bakteri Gram positif dan negatif, sehingga seluruhnya berjumlah lima variabel. Penelitian ini dikerjakan secara triplo. Setelah masing-masing stok variabel konsentrasi divortex, stok variabel konsentrasi dituangkan dalam 4 cawan petri berbeda yang telah diberi cakram uji kosong 1 cawan petri berisi 3 kertas disk kosong yang direndam selama 30 menit atau sampai menjadi jenuh untuk kemudian dipakai dalam tahap pengujian. 3.8.1.5. Pembuatan Media Sebanyak 19 g MHA ditimbang dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml lalu ditambahkan dengan aquades sampai menjadi 500 ml, serta dipanaskan sambil diaduk sampai semua bahan larut dengan sempurna, kemudian disterilkan dalam autoclave selama 120 menit dengan suhu 121°C dan tekanan sebesar 1,5 atm. 3.8.1.6. Regenerasi Bakteri Pembuatan stok bakteri ini dilakukan untuk memperbanyak dan meremajakan bakteri, dengan cara menginokulasikan 1 ose biakan murni bakteri Staphylococcus aureus ke dalam MHA, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam di dalam inkubator.

3.8.2. Tahap Pengujian

3.8.2.1 Uji Penghambatan Pertumbuhan Bakteri Bakteri diencerkan dengan mencampurkan 1 ose suspensi bakteri Staphylococcus aureus ke dalam tabung reaksi yang telah berisi NaCl steril. Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan kekeruhannya distandarisasi dengan konsentrasi 0.5 Mc Farland agar jumlah bakteri memenuhi syarat untuk uji kepekaan yaitu: 10 5 –10 8 ml. Kemudian larutan bakteri dioleskan pada media pertumbuhan MHA. Cakram uji kosong yang telah direndam di dalam masing- masing stok konsentrasi ekstrak daun sirih hijau tadi diletakkan di atas permukaan agar secara steril di dalam laminar air flow. Lalu media diinkubasi ke dalam inkubator. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 24 jam, keesokan harinya diukur diameter zona terang clear zone yang terbentuk dengan menggunakan penggaris.