Gram 1853-1938 pada tahun 1882 namun baru dipublikasikan tahun 1884 untuk membedakan Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumoniae pada
jaringan paru. Ini merupakan metode pewarnaan diferensial untuk membedakan
spesies bakteri menjadi 2 kelompok besar Gram-positif dan Gram-negatif berdasarkan bahan penyusun dinding sel secara fisik dan kimiawi. Reaksi ini
membagi eubakteria menjadi dua kelompok mendasar sesuai dengan kemampuannya menyerap warna. Pewarnaan Gram tidak digunakan untuk
mengklasifikasikan archaea, karena mikroorganisme ini memberikan respon yang sangat berbeda-beda.
Sridhar menuliskan pewarnaan Gram terdiri atas 4 komponen, yaitu:
Pewarna primer kristal violet, metil violet, atai Gentian violet
Pengikat zat warna iodin Gram
Decolorizer etil alkohol, aseton, atau campuran etanol-aseton 1:1
Counterstain larutan fukhsin karbol, safranin, atau neutral red
II.4.1.1 Mekanisme reaksi pada pewarnaan-Gram
Rao Sridhar menuliskan banyak teori telah diajukan untuk menjelaskan mengapa beberapa bakteri dapat mempertahankan
pewarnaan, dan yang lainnya tidak. Teori perbedaan pH sitoplasma pH 2 pada bakteri Gram-positif dan pH 3 pada bakteri Gram-negatif,
dan keberadaan Magnesium ribonukleat pada bakteri Gram-positif dan absensinya pada bakteri Gram-negatif tidak mendapatkan pengakuan
secara luas. Ketebalan dari dinding sel bakteri Gram-positif dan kandungan
lipid yang lebih banyak pada dinding sel bakteri Gram-negatif memiliki alasan yang lebih dapat diterima untuk menjelaskan reaksi
pewarnaan Gram. Dipercaya bahwa muatan positif kristal violet yang melewati dinding sel serta membran sel berikatan dengan komponen
bermuatan negatif pada bagian dalam sel. Tambahan dari muatan negatif iodin berikatan dengan muatan positif pewarna dan membentuk
suatu kompleks ikatan pewarna-iodin yang besar di dalam sel. Kristal violet heksametil-para-rosanilin klorida berinteraksi
dengan KI-I
2
cair melalui suatu pertukaran anion sederhana untuk menghasilkan presipitat kimia. Anion klorida yang kecil digantikan
dengan iodida yang sangat besar, lalu kompleks tersebut terbentuk dan terlarut dalam air. Selama proses penghilangan warna, alkohol
memecah lipid yang berada pada membran luar dari sel bakteri Gram- negatif dan melepaskan kompleks pewarna-iodin pada bagian luar sel.
Suatu lapisan peptidoglikan tipis tidak pula memberikan ketahanan yang cukup. Kompleks pewarna-iodin terlepaskan dari sel Gram-
negatif bersamaan dengan membran luar. Sehingga sel Gram-negatif kehilangan warna. Di sisi lain, sel Gram-positif mengalami dehidrasi
akibat pemberian etanol dan menutup pori-porinya bersamaan dengan penyusutan dinding sel selama dehidrasi.
Kompleks pewarna-iodin terperangkap di dalam lapisan tebal dari peptidoglikan, dan tidak terbilas oleh etanol.
II.4.1.2 Keterbatasan pewarnaan-Gram
