UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.4 Preparasi Bakteri Uji
3.3.4.1 Purifikasi dan Karakterisasi Bakteri Uji pada Media Luria Bertani
Agar
Tujuan dilakukan purifikasi bakteri uji adalah untuk memurnikan biakan bakteri uji dari kultur murni S. aureus. Teknik yang digunakan adalah Streak
Plate. Jarum ose dipanaskan terlebih dahulu hingga berpijar, dan didinginkan. Kemudian bakteri diambil dari kultur murni dan digoreskan pada media luria
bertani agar lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam Deby et al., 2010 dan dilakukan pengamatan secara morfologis terhadap bakteri uji yang telah
dipurifikasi serta dilakukan karakterisasi bakteri dengan pewarnaan Gram.
3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Diambil sebanyak satu ose bakteri uji yang telah dipurifikasi pada media luria bertani agar dan dimasukkan ke dalam tabung berisi 10 mL media heterotrof
HTR cair dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
°
C. Tabung yang berisi kultur cair bakteri uji divorteks kemudian diukur nilai optical dencity Absorbansi
OD
600
untuk mengetahui konsentrasi suspensi bakteri tersebut Bjarnsholt, Thomas et al., 2011. Seluruh pengerjaan preparasi bakteri uji dilakukan secara
aseptis di dalam Laminar Air Flow LAF yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol, lalu disterilkan dengan UV yang dinyalakan selama lebih kurang
2 jam sebelum digunakan.
3.3.5 Optimasi Waktu Pembentukan Biofilm S. aureus
Pengujian dilakukan
menggunakan microtitierplate
flat-bottom polystyrene 96 wells, dengan cara memasukkan sebanyak 200 µL suspensi bakteri
ke dalam tiap wells kemudian di optimasi waktu inkubasinya. Bertujuan untuk mendapatkan waktu inkubasi optimal dalam membentuk biofilm. Variasi waktu
inkubasi yang digunakan adalah 1, 2, 3, dan 4 hari. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian
ditambahkan 200 µL larutan kristal violet 1 ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci kembali dengan menggunakan air
mengalir sebanyak 3 kali. Larutan etanol 96 sebanyak 200 µL dimasukkan ke
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan pembacaan pertumbuhan biofilm Absorbansi OD
595
menggunakan alat iMark- Biorad Microplate Reader. Pengujian dilakukan triplo dan dikerjakan secara
aseptis di dalam Laminar Air Flow LAF yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol, lalu disterilkan dengan UV yang dinyalakan selama lebih kurang
2 jam sebelum digunakan. Hasil nilai absorbansi terbesar dinyatakan sebagai pembentukan biofilm S. aureus yang optimal. Waktu inkubasi optimal digunakan
untuk kontrol negatif pada uji penghambatan pertumbuhan dan penghancuran biofilm S. aureus.
3.3.6 Uji Aktivitas Penghambatan dan Penghancuran Biofilm S. aureus
Secara In Vitro Prasasti dan Hertiani, 2010; Sandasi et al., 2010
3.3.6.1 Uji Penghambatan Pertumbuhan dan Perkembangan Biofilm
Tujuan dilakukan uji penghambatan pertumbuhan biofilm adalah untuk mendapatkan aktivitas seduhan teh putih dalam penghambatan pertumbuhan
biofilm S. aureus. Pengujian dilakukan secara in vitro menggunakan microtitterplate flat-bottom polystyrene 96 wells. Dilakukan secara aseptis di
dalam Laminar Air Flow LAF yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol, lalu disterilkan dengan UV yang dinyalakan selama lebih kurang 2 jam
sebelum digunakan. Suspensi bakteri uji, seduhan daun teh putih dan media dimasukkan dalam
waktu bersamaan. Ke dalam tiap well dimasukkan media HTR sebanyak 60 µL, suspensi bakteri uji sebanyak 70 µL dan seduhan daun teh putih sebanyak 70 µL
dengan variasi konsentrasi 1, 2, 4, dan 8 vv. Kemudian diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37
°
C. Setelah masa inkubasi, microplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian ditambahkan 200 µL
larutan kristal violet 1 ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci kembali menggunakan air mengalir sebanyak 3 kali.
Larutan etanol 96 sebanyak 200 µL dimasukkan ke tiap well dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan pembacaan pertumbuhan
biofilm Absorbansi OD
595
menggunakan alat iMark-Biorad Microplate Reader.