sebaiknya air dipisahkan terlebih dahulu dari fraksi minyak antara lain dengan cara pengendapan. Pada proses pengendapan, karena pengaruh berat jenis air lebih
besar dari pada berat jenis minyak, maka akan terjadi bagian air mengendap di sebelah bawah, dan minyak akan berada pada lapisan bagian atas. Selanjutnya
bagian minyak dipisahkan dari bagian air, kemudian dilakukan perebusan pada suhu 45 ºC dan bagian air dapat dimanfaatkan untuk dibuat ekstrak air maupun
dapat dikonsumsi langsung.
C. Pengaruh Ekstrak dan Minyak Buah Merah Terhadap Proliferasi Sel
Limfosit
Pengujian proliferasi sel limfosit dengan metode MTT Hasil penetapan absorbansi dapat dilihat pada Lampiran 7, sedangkan peningkatan
proliferasi pertumbuhan sel limfosit dapat dilihat pada Gambar 8.
50 100
150 200
250
8,3 33,3
66,7 Dosis Ugml
Ni lai pr
oli fer
as i s
e l
li m
fos it
Eks air Eks metanol
Minyak Eks heksan
Gambar 8 Persentase pertumbuhan sel limfosit
Pada gambar 8 terlihat peningkatan proliferasi sel limfosit paling tinggi terjadi pada ekstrak air, menyusul minyak, ekstrak metanol, dan n-heksan, hal ini
dimungkinkan disebabkan oleh kandungan zat bioaktif dari buah merah yang larut air dan larut minyak dapat berfungsi meningkatkan proliferasi sel limfosit. Zat
yang larut air antara lain vitamin C, vitamin C, B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
, B
12
, biotin,
asam folat. Adapun proliferasi sel limfosit sangat tinggi terjadi pada ekstrak air, hal ini kemungkinan disebabkan oleh zat aktif yang terlarut di dalam ekstrak air
mempunyai sifat memacu proliferasi sel limfosit sehingga secara otomatis dapat menurunkan sifat toksisitas dari sel limfosit.
Demikian pula pada minyak buah merah terjadi peningkatan proliferasi sel limfosit lebih tinggi dari pada ekstrak metanol dan ekstrak n-heksan, hal ini
kemungkinan disebabkan oleh kandungan zat aktif yang terlarut di dalam lemak atau minyak buah merah tersebut mengandung zat aktif yang dapat menyebabkan
peningkatan proliferasi sel limfosit, zat aktif tersebut antara lain vitamin A,D,E tokoferol dan vitamin K. Menurut Ebadi 2002,
β-karoten merupakan provita min A yang berasal dari tanaman, vitamin C,
β-karoten, dan tokoferol vitamin E bersifat sebagai antioksidan, selain itu lycopene dan
β-karoten mempunyai efek pada kekebalan. Hasil penelitian Zakaria, at al. 2000 b, suplementasi buah dan
sayur mengandung vitamin C dan E dapat meningkatkan proliferasi limfosit dan aktivitas sitotoksik NK. Penelitian toksisitas seluler dan proliferasi sel telah
dilakukan secara in vitro menggunakan sel limfosit manusia, hal ini sesuai dengan Castell dan Gomez 1997, sel mast dari plasenta manusia, timus dan sel limfosit
dalam keadaan segar selalu digunakan untuk penelitian toksisitas seluler. Terlihat ekstrak air pada dosis rendah, sedang dan dosis tinggi mempunyai persentase
proliferasi sangat tinggi, lebih dari 200, menyusul ekstrak metanol pada dosis rendah dan dosis sedang terjadi peningkatan diatas 100, sedikit menurun pada
dosis tinggi. Minyak pada dosis rendah dan sedang terjadi sedikit peningkatan hingga kisaran 50, tetapi dosis besar terjadi peningkatan persentase proliferasi
cukup tinggi mendekati 150, hingga melampaui ekstrak metanol dan heksan, sehingga dapat dikatakan bahwa minyak baru bisa berefek mulai dari dosis
sedang. Pada ekstrak heksan dosis rendah, sedang dan dosis tinggi terjadi peningkatan proliferasi walau hanya lemah yaitu kisaran 50. Hasil analisa
statistik dengan t-Test menunjukkan ekstrak air, metanol, heksan dan minyak buah merah aktivitas proliferasi rata-rata dibanding rata-rata proliferasi kontrol -
mengalami peningkatan secara nyata p ≤0.05. Kecuali itu aktivitas proliferasi
sel limfosit yang ditambahkan ekstrak dan minyak buah merah dibanding dengan sel limfosit kontrol - terjadi peningkatan yang nyata p
≤0.05, yaitu ekstrak air
paling tinggi, menyusul minyak, ekstrak metanol, dan terendah ekstrak heksan. Hasil penggabungan dengan data dosis uji, hasil persentase peningkatan
proliferasi sel limfosit dari Yessica 2006, dapat dilihat pada Gambar 9. Pada Gambar 9 terlihat bahwa pada dosis 4,2; 8,3 dan 16,7 terjadi kenaikan
proliferasi sel limfosit ringan pada kisaran 50, hal ini hampir seiring antara ekstrak air, metanol, heksan dan minyak. Mulai dosis 33,3; 66,7 ekstrak air
terlihat terjadi kenaikan proliferasi sel limfosit sangat tinggi yaitu lebih dari 200 menyusul minyak, ekstrak metanol dan ekstrak n-heksan. Dapat dikatakan bahwa
hasil penelitian dengan tiga tingkatan dosis dan lima tingkatan dosis tidak ada perubahan, tetap urutan peningkatan proliferasinya berturut-turut ekstrak air
paling tinggi, menyusul minyak, ekstrak metanol dan ekstrak n-heksan.
50 100
150 200
250
4,2 8,3
16,7 33,3
66,7 dosis Ugml
Nil a
i p ro
lif er
as i s
e l
li m
fo s
it Eks air
Eks metanol minyak
Eks heksan
Gambar 9 Persentase pertumbuhan sel limfosit dengan lima dosis Faktor penyebab terjadinya peningkatan proliferasi tersebut kemungkinan
disebabkan oleh kandungan bioaktif yang terdapat di dalam buah merah yang diteliti, baik kandungan zat aktif yang larut di dalam air maupun di dalam minyak.
Hal ini sesuai dengan hasil penelitian terhadap sampel uji yang dilakukan oleh Yessica, 2006. Adapun penelitian tersebut meliputi kandungan bioaktif yang larut
air, diperoleh hasil : Kadar fenol ekstrak air adalah 26.4 ppm, ekstrak metanol : 23.1 ppm, ekstrak heksan : 13.1 ppm dan kadar fenol dari minyak buah merah
adalah 18.9 ppm. Hasil penelitian terhadap zat bioaktif yang larut minyak adalah
kadar karotenoid ekstrak air : 0.4 ppm, ekstrak metanol : 1.2 ppm, ekstrak heksan : 1.6 ppm dan kadar karotenoid minyak : 4.2 ppm. Sedangkan kadar vitamin E
dari ekstrak air adalah 188.7 ppm, dari ekstrak metanol : 432.9 ppm, ekstrak heksan : 114.0 ppm dan kadar vitamin E dari minyak buah merah adalah 442.9
ppm. Selain hasil penelitian tersebut, dikuatkan pula dengan dilakukannya penelitian kandungan zat bioaktif dari sampel yang lain oleh Andarwulan et al.
2006, Hasil penelitian tersebut antara lain ekstrak biji buah segar mengandung total karotenoid 647,2 ppm,
β-karoten 1.9 ppm, total tokoferol 802,6 ppm, α tokoferol 425,5 ppm. Minyak buah merah mengandung total karotenoid 55.0
ppm, β-karoten 9.2 ppm, total tokoferol 42.0 ppm, dan α tokoferol 3.7 ppm.
Selain itu telah dilakukan pula penelitian sifat fisiko-kimia terhadap ekstrak buah merah seperti viskositas, indeks bias, berat jenis, titik asap, titik cair, kadar air,
bilangan asamFFA, peroksida, penyabunan dan bilangan Iod Andarwulan et al,
2006. Pada kondisi dan konsentrasi yang sama, ekstrak air buah merah dapat
menyebabkan peningkatan proliferasi sel limfosit paling tinggi, menyusul minyak, eksrak metanol, dan ekstrak heksan, hal ini kemungkinan besar disebabkan
terjadinya sinergisme antara komponnen-komponen bioaktif di dalam ekstrak dan minyak buah merah tersebut, walaupun masih perlu dilakukan penelitian untuk
pembuktiannya. Sifat sinergisme antara komponen bioaktif tersebut telah disampaikan oleh
beberapa peneliti lain, misalnya menurut Zakaria et al. 2000, pada konsentrasi dan kondisi yang sama, ekstrak air jahe lebih mampu untuk menghambat
pembentukan malonaldehida dibandingkan dengan α-tokoferol. Sinergisme antara
antioksidan fenolik pada ekstrak air jahe mungkin mempengaruhi penghambatan pembentukan malonaldehida.
Menurut Nurrahman et al. 1999, Adanya sinergisme menyebabkan konsumsi kombinasi isoflavon dan
α-tokoferol akan menurunkan konsentrasi malonaldehid, meskipun konsumsi isoflavon tidak berpengaruh terhadap
penurunan kadar malonaldehida dari LDL teroksidasi. Minyak dan ekstrak kasar dari buah merah cukup baik untuk meningkat
kan proliferasi dan tidak toksik terhadap sel limfosit manusia, maka tidak perlu di
fraksinasi dari ekstrak tersebut. Skema prosedur uji proliferasi dan toksisitas sel dapat dilihat pada Lampiran 9.
Hasil foto proliferasi sel limfoait Kultur yang telah ditambahkan ekstrak dan minyak buah merah serta
kontrol - maupun kontrol + diinkubasi di dalam inkubator CO
2
selama 72 jam, kemudian dilakukaan pengambilan foto. Hasil foto dari suspensi limfosit yang
dikultur dengan penambahan ekstrak air, minyak, ekstrak metanol dan ekstrak heksan dapat dilihat pada Gambar 10.
Kontrol - Ekstrak air Minyak
Ekstrak metanol Ekstrak heksan Kontrol +
Gambar 10 Proliferasi sel limfosit yang ditumbuhkan pada media dengan penambahan ekstrak dan minyak buah merah
Pada Gambar 11 terlihat bahwa kontrol - terlihat terjadi proliferasi sel limfosit, tetapi tidak terlalu banyak bila dibanding dengan ekstrak air. Untuk minyak terjadi
proliferasi sel lebih banyak dari pada kontrol -, tetapi lebih sedikit dari pada ekstrak air, begitu pula pada ekstrak metanol terjadi proliferasi lebih banyak
apabila dibanding dengan kontrol -, tetapi lebih sedikit dari pada ekstrak air dan minyak. Selanjutnya, pada ekstrak heksan terlihat terjadi proliferasi lebih banyak
apabila dibandingkan dengan kontrol - tetapi lebih sedikit dari pada ekstrak air, minyak dan metanol. Pada minyak terlihat sedikit kotor karena kemungkinan di
dalam kultur masih ada fraksi minyak yang ikut. Untuk kontrol + terlihat terjadi proliferasi sel lebih banyak dari pada kontrol - tetapi lebih sedikit bila dibanding
dengan ekstrak air, minyak, ekstrak metanol, dan heksan. Berdasarkan perhitungan secara statistik menggunakan analisa statistik
dengan t-T est: Two sample assuming equal variances PT ≤t one –tail = 0,01
terhadap ekstrak air, minyak, ekstrak metanol, dan ekstrak heksan buah merah, didapat hasil perhitungan bahwa dengan penambahan ekstrak air, minyak, ekstrak
metanol, dan ekstrak heksan dari buah merah ke dalam suspensi sel limfosit di dalam media kultur, dapat menyebabkan peningkatan proliferasi sel limfosit
secara signifikan. Perhitungan analisa statistik tersebut dapat dilihat pada Lampiran 12,13,14 dan 15.
Dari hasil tersebut dapat terlihat bahwa proliferasi sel limfosit tertinggi terjadi pada penambahan ekstrak air, menyusul penambahan minyak, ekstrak
metanol, dan terendah terjadi pada penambahan ekstrak heksan. Berdasarkan hasil perhitungan analisa statistik dan dikuatkan dengan hasil
foto pemeriksaan secara mikroskopik tersebut dapat disimpulkan bahwa secara umum dengan penambahan ekstrak air, minyak, ekstrak metanol, ekstrak heksan
dengan konsentrasidosis meningkat dapat menyebabkan peningkatan proliferasi sel limfosit. Pada penambahan ekstrak air dan minyak buah merah menyebabkan
peningkatan proliferasi sel limfosit sangat tinggi. Hasil Penghitungan EC
50
EC
50
Effective Concentration
50
adalah suatu dosis konsentrasi dimana pada dosis tersebut sudah dapat menyebabkan efek proliferasi 50. Penghitungan EC
50
adalah dengan cara persamaan garis regresi linier. Secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 4.
Hasil penghitungan Effective Concentration
50
EC
50
dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9 Hasil EC
50
ekstrak air, metanol, heksan dan minyak buah merah dari berbagai konsentrasi
Ekstrak Air
Metanol Heksan
Minyak EC
50
µgml 0,97
0,98 1
1,6
Dari data diatas dapat dilihat bahwa EC
50
terendah adalah ekstrak air, menyusul ekstrak metanol, ekstrak heksan, dan tertinggi adalah minyak. Hal ini membukti
kan bahwa sifat polaritas dari ekstrak cenderung sangat mempengaruhi kemampuan menimbulkan proliferasi, makin tinggi polaritas dari ekstrak makin
kecil dosis yang diperlukan untuk dapat menimbulkan proliferasi. Contoh lain dari pehitungan EC
50
adalah penelitian dari Lisdawati 2002, tentang bioasai anti kanker terhadap sel leukomia L1210 dengan penambahan beberapa macam
ekstrak kasar buah mahkota dewa [Phaleria macrocarpa Scheff. Boerl.]. Hasil EC
50
dapat dilihat pada Tabel 10.
Tabel 10 Hasil bioasai anti kanker dan EC
50
dengan sel leukomia L1210 terhadap ekstrak kasar etil asetat daging buah, metanol daging buah,
n-heksan kulit biji, etil asetat kulit biji dan metanol kulit biji mahkota dewa [Phaleria macrocarpa Scheff. Boerl.]
h
Jenis ekstrak Dosis
µgml Jumlah sel
X 10
4
Efektifitas EC
50
µgml 12
3 96.6
Eks. kasar etil asetat daging buah 10
29 67.2
5.76 5
47 46.9
88.5 12
19 78.5
Ekstrak kasar metanol daging buah 10
35 60.5
5.80 5
46 48.0
88.5 12
6 93.2
Ekstrak kasar n-heksan kulit biji 10
21 76.3
5.35 5
46 48.0
88.5 12
4 95.5
Ekstrak kasar Etil asetat kulit biji 10
11 87.6
5.0 5
34 61.6
88.5 12
16 81.9
Ekstrak kasar metanol kulit biji 10
30 77.4
7.47 5
61 23.2
88.5
h
Lisdawati 2002
Pada tabel 12 terlihat bahwa EC
50
ekstrak kasar etil asetat daging buah :
5.76
µgml, ekstrak kasar metanol daging buah :
5.80
µgml, ekstrak kasar n-heksan kulit biji : 5.35
µgml, ekstrak kasar etil asetat kulit biji µgml dan ekstrak kasar metanol kulit biji : 7.47 µgml. EC
50
dari ekstrak buah mahkota dewa [Phaleria macrocarpa
Scheff. Boerl.] terhadap sel leukemia L1210 adalah 5.0-
7.47
µgml, dosis ini lebih besar bila dibanding dengan EC50 dari ekstrak dan minyak buah merah terhadap efektifitas peningkatan proliferasi sel limfosit yaitu 0.97-1.6
µgml. Perbedaan dosis tersebut kemungkinan disebabkan perbedaan zat bioaktif antara kedua ekstrak tersebut. Selain itu karena mekanisme untuk menimbulkan
efek pada sel limfosit berbeda dengan mekanisme untuk menimbulkan efek pada sel leukomia L1210.
D. Pengaruh Ekstrak dan Minyak Buah Merah Terhadap Toksisitas Sel