terus menerus selama 72 jam menggunakan termostart, sehingga keluar minyak, kemudian minyak yang terjadi ditimbang untuk menentukan rendemen.
E. Penentuan Dosis Uji Konsentrasi Ekstrak
Untuk menentukan dosis konsentrasi uji didasarkan pada pendekatan dosis referensi yang diminum orang, yaitu 10 ml per hari dan diperhitungkan dengan
pengenceran di dalam darah manusia. Cara penentuan dan hasil penghitungan dosis uji konsentrasi ekstrak dapat dilihat pada Lampiran 2. yaitu : 66,7; 33,3 dan
8,3 µgml sebagai dosis normal. Dosis kontrol + yaitu lipopolisakarida maupun concanavalin A adalah 50 µgml.
F. Pengujian Proliferasi Sel Limfosit
Persiapan ekstrak, pereaksi, media kultur 1. Persiapan ekstrak
Ekstrak n-heksan dan minyak buah merah dipersiapkan dengan menambahkan 0.15 ml tween 80 ke dalam 0.85 ml ekstrak, sehingga konsentrasi tween pada
kultur sebesar 3. Setelah itu, dibuat pengenceran bertingkat, sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak 66,7
μgml, 33,3 μgml dan 8,3 μgml. Pada ekstak air dan metanol langsung diencerkan secara bertingkat sehingga diperoleh konsentrasi
ekstrak 66,7 μgml, 33,3 μgml dan 8,3 μgml. Pada ekstrak air dan metanol yang
dapat larut dengan pelarut polar, langsung dilakukan pengenceran bertingkat, sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak C1 66,7
μgml, C2 33,3 μgml dan C3 8,3
μgml.
2. Persiapan pereaksi Pembuatan phosphate buffer saline PBS, komposisi PBS yang digunakan yaitu
NaCl, KCl, KH
2
PO
4
, Na
2
HPO
4
Na
2
HPO
4.
2H
2
O, kemudian semua bahan tersebut dicampur dan dilarutkan dalam 500 ml aquabidest dan diatur hingga mencapai pH
7,2. Kemudian larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi milipore yang berdiameter 0,22 µm. pada Lampiran 6.
Pembuatan indikator biru trifan 0,20 , bubuk trifan biru sebanyak 0,04 g dilarutkan dalam 20 ml PBS dan diaduk hingga homogen.
3. Persiapan larutan media kultur
Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640 Lampiran3. Bubuk RPMI sebanyak 10,42 g dilarutkan dalam 11 aquabidest, kemudian ditambahkan
2 g NaHCO
3
, dan 1 penisilin-streptomisin. Untuk kultur 90 ml RPMI-1640 ditambahkan 10 ml Fetal Bovine Serum FBS. Larutan tersebut disterilisasi
dengan membran sterilisasi milipore yang berdiameter 0,22 µm. Untuk pembuatan MTT 0,5, bubuk MTT sebanyak 0,25 g dilarutkan
dalam 50 ml PBS dan diaduk hingga homogen. Kemudian larutan disterilisasi dengan membran sterilisasi milipore yang berdiameter 0,22 µm.
Pembuatan isopropanol-HCl 0,04 N dilakukan dengan cara Isopropanol sebanyak 100ml ditambah dengan HCl pekat sebanyak 339 ml.
Isolasi limfosit. Limfosit diisolasi dari darah perifer mahasiswa dewasa sehat, jenis
kelamin laki-laki. Pengambilan darah dilakukan oleh seorang perawat, dengan cara darah diambil lewat vena sejumlah 50 ml dengan menggunakan tabung
vacutaener steril yang berisi EDTA 5, kemudian digoyang pelan-pelan,
disentrifuse dengan kecepatan 2500 RPM selama 30 menit. Terlihat ada 3 lapisan, lapisan paling atas berwarna kuning dibuang menggunakan mikropipet, lapisan
tengah disisakan 1 cm lalu diambil menggunakan mikropipet, kemudian dimasukkan kedalam tabung valkon steril berisi larutan ficoll 3 ml dengan cara
dialirkan melewati dinding tabung secara pelan-pelan, kemudian disentrifuse lagi dengan kecepatan 2.500 rpm selama 30 menit pada suhu kamar, terlihat bentukan
cincin ditengah, bagian atas cincin dibuang, diambil cincin tersebut setinggi ½ cm bersama cairan dibawahnya dan ½ cm cairan di atasnya, lalu ditambahkan media
RPMI hingga 9 ml. Tabung disentrifuse lagi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit pada suhu kamar, terjadi endapan limfosit. Endapan dicuci dengan RPMI
sebanyak dua kali, ditambahkan RPMI sebanyak 5 ml, selanjutnya sel limfosit dihitung menggunakan hematositometer dengan cara mengambil 20
µl
suspensi
limfosit, lalu ditambah dengan biru tripan sebanyak 20
µl, di
aduk dengan mikropipet, kemudian sel limfosit dilihat dan dihitung menggunakan mikroskop
pada perbesaran 200 X. Jumlah sel limfosit dapat dihitung dengan rumus, lalu dilakukan pengenceran suspensi limfosit sehingga didapat konsentrasi sel 10
6
ml. Rumus cara penghitungan sel limfosit dengan menggunakan hematositometer
yaitu : N = Jumlah sel limfosit
A = Jumlah sel hidupmati rata-ratabidang pandang.
FP = Faktor pengenceran
Kultur Sejumlah 80 µl suspensi limfosit dimasukkan ke dalam masing-masing
sumur pada mikrokultur, kemudian masing-masing sumur ditambah dengan 20 µl ekstrak air, ekstrak metanol, ekstrak heksan atau minyak, Untuk kontrol +, sel
limfosit dikultur dengan 20 µl lipopolisakarida LPS maupun concanavalin A Con A. Sebagai kontrol -, suspensi sel limfosit dikultur dengan media standard
tanpa dilakukan penambahan apapun, lalu kesemuanya diinkubasi ke dalam inkubator
CO
2
pada 37 °C, 5 CO
2,
95 O
2
RH 96 selama 72 jam. Kemudian dilakukan pemotretan dan dilihat terjadinya proliferasi sel limfosit. Penghitungan
dan penetapan proliferasi sel limfosit dilakukan dengan dua cara yaitu dengan cara manual menggunakan pewarnaan biru trifan, dan dengan cara pewarnaan MTT.
Penghitungan secara manual dilakukan dengan cara suspensi limfosit yang telah diinkubasi selama 72 jam kemudian suspensi limfosit tersebut diambil 20 µl
ditambah 20 µl larutan biru trifan, diaduk, lalu dihitung kematian sel limfosit menggunakan hematositometer dan dilihat di mikroskop pada perbesaran 200x.
Penetapan proliferasi sel limfosit secara kimia metode MTT dilakukan dengan cara menambahkan larutan MTT 3-{4,5-dimethylthiasol-2-yl}-2,5-
diphenyl-tetrasolium, sebanyak 10 µl ke dalam masing-masing sumur pada saat setelah kultur diinkubasi di dalam inkubator CO
2
selama 72 jam, diaduk, diinkubasi kembali di dalam inkubator CO
2
selama 4 jam, selajutnya ditambahkan larutan isopropanol-HCl sebanyak 100 µl pada masing-masing sumur, kemudian
absorbansinya ditentukan dengan spectrophotometer microplate reader pada N = A x FP x 10
4
selml
panjang gelombang 570 nm. Hasil absorbansi kemudian dapat dihitung persentase aktivitas proliferasi dari sel limfosit dengan rumus berikut dan dihitung EC50 nya
menggunakan analisa linieritas regresi ganda. Aktivitas proliferasi sel limfosit selanjutnya dianalisa secara statistik menggunakan analisa statistik dengan t-Test:
Two sample assuming equal variances PT
≤t one –tail = 0,01. Rumus persentase
Pertumbuhan sel =
Skema prosedur uji proliferasi dan uji toksisitas sel limfosit dapat dilihat pada
lampiraan Gambar 1, 2 dan 3
G. Penghitungan EC
