18
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan eksperimental murni sederhana, yaitu melihat pengaruh
sifat fisik dan stabilitas fisik yang dihasilkan dari pembuatan sediaan gel ekstrak daun mengkudu dengan perbedaan konsentrasi CMC-Na.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas dalam penelitan ini adalah variasi jumlah konsentrasi CMC-
Na sebagai gelling agent yang dinyatakan dalam satuan persen. b.
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat fisik gel daya sebar dan viskositas dan stabilitas gel perubahan viskositas dan daya sebar
setelah 28 hari penyimpanan. c.
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah daun mengkudu yang digunakan, konsentrasi dari ekstrak daun mengkudu, lama
penyimpanan gel, lama pencampuran sediaan gel daun mengkudu, alat-alat percobaan, umur tikus, jenis kelamin tikus, galur tikus, berat badan tikus,
kedalaman pembuatan luka terbuka insisi pada tikus, pakan dan kandang tikus.
d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah suhu ruangan,
kelembapan ruangan, kondisi penyimpanan gel selama uji stabilitas fisik, jumlah kontaminan yang masuk dalam gel, kecepatan perputaran batang
viscometer, keadaan patofisiologi tikus, dan pergerakan tikus selama uji aktivitas.
2. Definisi operasional
a.
Gel penyembuh luka ekstrak daun mengkudu adalah sediaan semisolid
berbentuk gel yang mengandung ekstrak daun mengkudu dengan konsentrasi 5, menggunakan CMC-Na sebagai gelling agent dan propilen
glikol sebagai humektan, yang dibuat dengan formula yang telah ditentukan
dalam penelitian ini untuk pengobatan luka terbuka insisi.
b. Simplisia daun mengkudu adalah daun mengkudu yang telah dikeringkan
selama beberapa hari dan dihaluskan menjadi serbuk.
c.
Ekstrak daun mengkudu adalah ekstrak kental berwarna coklat tua
kehitaman dan bau khas daun mengkudu yang diperoleh dengan mengekstraksi simplisia daun mengkudu yang melewati proses maserasi
selama 3 hari dan remaserasi selama 3 hari menggunakan pelarut etanol 70, yang kemudian pelarutnya diuapkan dengan rotary evaporator selama
3 jam pada suhu 60
o
C dan diuapkan lagi pada penangas air dengan suhu 65
o
C selama 7 jam.
d.
Gelling agent adalah basis pembentuk sediaan gel yang dapat
mempengaruhi sifat fisik dan stabilitas fisik sediaan, pada penelitian ini
menggunakan CMC-Na yang dibuat dalam empat variasi konsentrasi.
e. Sifat fisik adalah parameter untuk mengetahui kualitas sediaan gel
penyembuh luka terbuka insisi dari ekstrak daun mengkudu, dengan mengukur besarnya viskositas dan daya sebar sediaan pada hari ke-2 dalam
suhu kamar.
f. Stabilitas fisik adalah parameter yang digunakan untuk mengetahui tingkat
kestabilan sediaan gel secara fisik, dengan mengukur besarnya perubahan viskositas dan daya sebar sediaan yang diamati pada penyimpanan gel hari
ke-7, 14, 21, dan 28 pada suhu kamar.
g. Kondisi uji stabilitas fisik adalah kondisi sediaan gel ektrak mengkudu
dalam wadah di dalam ruangan tertutup dengan suhu kamar 27
o
-30
o
C dan kelembapan ruang yang tidak terkendali serta tidak terkena sinar matahari
langsung.
h. Viskositas merupakan ukuran kekentalan suatu sediaan gel ekstrak daun
mengkudu untuk melihat kemudahan sediaan dikeluarkan dari wadahnya dan kemudahan pengaplikasiannya dengan satuan dPa.s. Kriteria
penerimaan nilai viskositas untuk sediaan semi solid sebesar 150-250 dPa.s
Garg, et al., 2002.
i. Daya sebar adalah ukuran penyebaran suatu sediaan gel ekstrak daun
mengkudu yang diukur dengan alat uji horizontal double plate yang diberi beban 125 g selama 1 menit untuk melihat kemampuan penyebaran sediaan
gel ekstrak daun mengkudu pada permukaan kulit, ditulis dalam satuan cm
2
. Kriteria penerimaan nilai daya sebar yang baik untuk sediaan semi solid
sebesar 5-7 cm Garg, et al., 2002 atau 19,625 – 38,465 cm
2
.
j. Perubahan viskositas adalah selisih nilai viskositas sediaan gel setelah
penyimpanan 28 hari dengan nilai viskositas sediaan pada hari ke-2 dibagi viskositas pada hari ke-2 dan kemudian dikali 100, ditulis dalam satuan
, kriteria penerimaannya 10.
k. Perubahan daya sebar adalah selisih nilai daya sebar sediaan gel setelah
penyimpanan 28 hari dengan nilai daya sebar sediaan pada hari ke-2 dibagi daya sebar pada hari ke-2 dan kemudian dikali 100, ditulis dalam satuan
, kriteria penerimaannya 10.
l. Uji aktivitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui efek
penyembuhan luka terbuka insisi yang ditimbulkan setelah pengaplikasian
sediaan gel ekstrak mengkudu.
m. Luka terbuka insisi adalah luka sayat yang dibuat sepanjang 5 cm secara
horizontal menggunakan silet pada punggung tikus yang bulunya telah
dicukur dengan kedalaman luka 2 mm.
n. Pengurangan panjang luka adalah selisih ukuran panjang luka pada hari
ketujuh dengan panjang luka awal dibagi panjang luka awal dikali 100,
ditulis dalam satuan .
C. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital analitik Ohaus, glasswares Pyrex-Germany, pengaduk kaca, sendok,
termometer, orbital shaker Innova 2100 Platform Shaker, rotary evaporator Buchi Labortechnik AG CH-9230, water bath, oven MEMMERT, autoklaf
MODEL KT-40, ALP Co. Ltd Midorigouka, Japan, cawan porselen, viscotester seri VT 04F Rion Japan, mixer Maspion, indikator pH universal Merck
Germany, horizontal double plate, gunting, scalpel, silet, jarum suntik, pipet tetes, stopwatch, dan penggaris.
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak daun mengkudu, etanol 70 kualitas farmasetis, aquadest, CMC F-SH kualitas
farmasetis, metil paraben kualitas farmasetis, propilen glikol kualitas farmasetis, dan ketamin hidroklorida 10 . Semua bahan diperoleh dari
Laboratorium Formulasi Teknologi Sediaan Padat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
E. Hewan Percobaan
Pada penelitian ini digunakan hewan uji berupa tikus jantan galur Wistar dengan bobot sekitar 120-180 gram dan umur 2-3 bulan, yang diperoleh dari PT.
Abadi Jaya. Sebelum digunakan untuk pengujian aktivitas sediaan gel ekstrak daun mengkudu, hewan uji perlu dikarantina dan dikelompokkan dalam lima
kelompok dengan tiga hewan uji pada masing-masing kelompok di dalamnya. Masing-masing kelompok hewan uji memiliki ukuran kandang yang sama yang di
dalamnya.
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan ekstrak daun mengkudu
Simplisia daun mengkudu yang berbentuk serbuk didapat dari laboratorium Biologi Farmasi UGM. Serbuk daun mengkudu ditimbang dan
dilarutkan dalam pelarut etanol 70 dengan perbandingan 1 : 3. Prosedur tersebut mengacu pada penelitian Nayak et al. 2009.
Setelah itu, dilakukan maserasi pada campuran tersebut selama 3 hari dan remaserasi selama 3 hari
menggunakan orbital shaker dengan penambahan pelarut sama dengan saat maserasi. Maserasi dilakukan pada suhu kamar. Hasil ekstraksi disaring dengan
kertas saring Whatman dengan bantuan corong Buchner yang dihubungkan dengan pompa vakum. Filtrat yang didapat dari hasil penyaringan diambil dan
diuapkan menggunakan rotary evaporator yang diatur pada suhu 60
o
C dengan kecepatan pemutaran pada skala 4 sehingga etanol dapat teruapkan.
Selanjutnya ekstrak hasil penguapan diuapkan lagi pada penangas air selama sekitar 7 jam pada suhu 65
o
C. Ekstrak kental yang didapat dilanjutkan pada tahap formulasi dan diuji aktivitasnya dengan mengaplikasikan ekstrak tersebut
pada tikus jantan galur Wistar.
2. Karakterisasi, uji kualitatif, dan uji kuantitatif senyawa aktif pada
ekstrak daun mengkudu
Karakterisasi ekstrak yang dilakukan pada penelitian ini ialah penetapan kadar air, kadar sari, dan kadar abu total pada ekstrak mengkudu. Ekstrak
kental daun mengkudu yang didapat dari proses sebelumnya, diambil secuplik untuk diuji kandungan senyawa aktifnya yaitu senyawa flavonoid, senyawa
triterpenoid, dan senyawa alkaloid. Uji kandungan senyawa tersebut dilakukan secara kualitatif triterpenoid dan alkaloid dan kuantitatif flavonoid dan
alkaloid. Pengujian ekstrak dilakukan di LPPT UGM Unit I Yogyakarta.
3. Formulasi sediaan gel
a. Formula
Formula yang digunakan dalam percobaan ialah sebagai berikut Tabel I :
Tabel I. Formula gel hasil orientasi
Bahan Formula
F I F II
F III F IV
Ekstrak daun mengkudu g 5
5 5
5
CMC-Na 2,5
3 3,5
4
Propilen glikol g Metil paraben g
12,5 0,1
12,5 0,1
12,5 0,1
12,5 0,1
Aquadest mL 78,4
78,4 78,4
78,4 Keterangan :
F I = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 2,5 bb
F II = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 3 bb
F III = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 3,5 bb
F IV = Formula gel dengan konsentrasi CMC-Na 4 bb
Penentuan bahan-bahan pada tabel di atas tabel I merupakan bahan umum yang biasa digunakan pada formulasi gel. Penentuan jumlah
konsentrasi berdasarkan hasil orientasi didapatkan dari literatur Rowe et al. 2009 yaitu CMC-Na sebagai gelling agent 3-6, propilen glikol
sebagai humektan ≤ 15, dan metil paraben sebagai pengawet 0,02- 0,3. Konsentrasi ekstrak daun mengkudu didapat dari jurnal penelitian
Yuslianti et al. 2013 yang menyebutkan bahwa ekstrak daun mengkudu pada konsentrasi 10 mgmL efektif menyembuhkan luka. Dari penelitian
tersebut konsentrasi ekstrak sebesar 10 mgmL = 1 g100 mL atau 1 bb, ditingkatkan 5 kalinya menjadi 5 bb untuk formulasi sediaan gel.
b. Formulasi sediaan gel
Peralatan gelas kaca yang digunakan pada formulasi gel disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit, sedangkan peralatan tidak terbuat dari kaca dicuci disemprot dengan etanol. CMC-Na dan
metil paraben disterilisasi menggunakan oven dengan suhu 160
o
C selama 1 jam. Propilen glikol dan aquadest disterilisasi dengan autoklaf juga.
CMC-Na dikembangkan dengan cara ditaburkan di atas aquadest yang sudah disterilkan dengan autoklaf campuran A, setelah itu didiamkan
selama 24 jam. Metil paraben dicampur dalam propilen glikol yang telah steril hingga terbentuk campuran yang homogen campuran B. Campuran
B dimasukkan dalam campuran A lalu dicampurkan hingga homogen menggunakan mixer selama 3 menit campuran C. Ekstrak daun
mengkudu kemudian dimasukkan ke dalam campuran C, campuran tersebut dihomogenkan hingga menit ke-5 campuran D. Terakhir
aquadest dimasukkan dalam campuran D sedikit demi sedikit sambil dilakukan pencampuran hingga homogen dengan mixer hingga menit ke-
10. Seluruh proses pencampuran pada formulasi dilakukan secara aseptis
di dalam Laminar Air Flow. Sediaan gel dikemas dalam suatu wadah tertutup rapat dan disimpan pada suhu kamar. Prosedur formulasi gel yang
dilakukan mengacu pada penelitian Sanjaya 2013 tentang pembuatan gel antiinflamasi dengan ekstrak daun petai cina.
Pada sediaan gel ekstrak daun mengkudu tidak dilakukan uji sterilitas karena berdasarkan penelitian-penelitian sebelumnya yaitu
penelitian Patel el al. 2011, Patil et al 2012, dan Sanjaya 2013, tidak dilakukan uji sterilitas pada sediaan penyembuh luka yang dibuat.
4. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel
a. Uji organoleptis
Sediaan gel yang sudah jadi diamati warna, bau, dan konsistensinya pada hari ke-2 dan 28. Hasil yang didapat dibandingkan
dengan hasil sediaan gel pada hari ke-2. b.
Uji pH Sediaan gel diukur pHnya pada hari ke- 2 dan 28 dengan pH
stick indikator universal. Hasil yang didapat dibandingkan dengan hasil sebelumnya untuk melihat apakah terjadi perubahan pH selama
penyimpanan 28 hari. c.
Uji viskositas dan perubahan viskositas Uji viskositas dilakukan tiga kali yaitu pada hari ke- 2, 7, 14,
21, dan 28. Masing-masing formula gel ditentukan viskositasnya menggunakan alat Viscotester Rion seri VT 04F dengan ukuran rotor
berskala 2. Perubahan viskositas diperoleh dengan mengetahui selisih
nilai viskositas pada hari ke-2 dengan nilai viskositas pada hari-hari selanjutnya hari ke- 7, 14, 21, dan 28, kemudian dibagi dengan nilai
viskositas gel pada hari ke-2 dan dikali 100. d.
Uji daya sebar dan perubahan daya sebar Sebanyak 1 gram gel ditimbang, diletakkan pada suatu
lempeng kaca bulat berskala. Pada pengukuran daya sebar, di atas lempeng tersebut ditangkupkan lempeng kaca lain berukuran sama
horizontal double plate. Kemudian lempeng tersebut ditindihi dengan beban 125 gram selama 1 menit dan diukur rata-rata diameter
sebarnya. Diameter yang diperoleh dihitung nilai daya sebarnya dengan perhitungan sebagai berikut :
Keterangan : S = nilai daya sebar cm
2
d = rata-rata diameter sebar cm π = 3,14
Uji ini dilakukan pada hari ke- 2, 7, 14, 21, dan 28. Perubahan daya sebar diperoleh dengan mengetahui selisih nilai daya sebar gel pada
hari ke-2 dengan nilai daya sebar pada hari-hari selanjutnya hari ke- 7, 14, 21, dan 28, kemudian dibagi dengan nilai daya sebar gel pada hari
ke-2 dan dikali 100.
5. Uji aktivitas penyembuh luka
Hewan uji tikus jantan galur Wistar dibius dengan menggunakan ketamin hidroklorida secara intravena. Selanjutnya, bulu
bagian dorsal dibasahi dengan air dan dibuat tanda area lalu bulu dorsal
tikus dicukur dengan pisau cukur steril. Area bulu yang telah dicukur lalu ditandai dengan spidol untuk mengetahui panjang luka yang diinginkan.
Luka dibuat secara horizontal dengan cara menyayat bagian yang telah ditandai sepanjang 5 cm dengan kedalaman luka 2 mm.
Hewan uji dibagi menjadi beberapa kelompok yaitu kelompok kontrol tanpa perlakuan, kelompok ekstrak, kelompok kontrol positif
salep Betadine
®
, kelompok kontrol negatif sediaan gel tanpa ekstrak daun mengkudu basis gel, dan kelompok gel ekstrak daun mengkudu.
Masing-masing kelompok sebanyak tiga hewan uji. Uji aktivitas kemampuan penyembuhan luka terlebih dahulu dilakukan pada kelompok
ekstrak dan kelompok kontrol tanpa perlakuan karena digunakan sebagai uji orientasi untuk mengetahui kemampuan ekstrak daun mengkudu dalam
menyembuhkan luka. Pengujian pada kelompok ekstrak dilakukan dengan mengoleskan ekstrak di sepanjang area luka selama 7 hari berturut-turut.
Sedangkan pada kelompok tanpa ekstrak, tikus yang sudah dilukai tidak diberikan perlakuan apapun, hanya dilihat pengurangan panjang lukanya
dari awal pembuatan luka hingga hari ke-7. Hewan uji pada kelompok kontrol negatif dan positif yang sudah dilukai, diolesi dengan sediaan
yang sudah ditentukan sebanyak 1 gram, sediaan diaplikasikan secara merata di sepanjang luka yang dibuat. Pada kelompok kontrol negatif
diaplikasikan gel tanpa ekstrak daun mengkudu sedangkan pada kelompok kontrol positif diaplikasikan sediaan penyembuh luka semi solid yang ada
di pasaran salep Betadine
®
. Pengaplikasian sediaan tersebut dilakukan
setiap hari dari awal tikus dilukai hari ke-0 hingga hari ke-7. Hewan uji pada kelompok perlakuan yang sudah dilukai, diolesi dengan sediaan gel
ekstrak daun mengkudu secara merata sebanyak 1 gram di sepanjang luka yang dibuat selama 7 hari. Tingkat penutupan luka diukur dan dicatat
setiap hari hingga hari ke- 7. Hasil pengukuran tersebut kemudian dibuat grafik. Data yang didapatkan dari hasil pengujian dianalisis menggunakan
uji Anova. Perhitungan terkait pengurangan panjang luka diacu dari penelitian Patel et al. 2011 terkait dengan perhitungan aktivitas luka
eksisi.
G. Analisis Data
Data yang diperoleh dalam penelitian ialah data sifat fisik, stabilitas fisik selama penyimpanan, dan aktivitas gel ekstrak daun mengkudu. Hasil data
penelitian yang didapat dianalisis dengan uji Shapiro-Wilk untuk melihat normalitas distribusi data. Kesamaan varian data atau homogenitas data dianalisis
dengan uji Levene’s Test. Kedua uji analisis tersebut apabila hasilnya memenuhi
uji statistik parametik maka diteruskan dengan uji Anova dan uji T test untuk mengetahui signifikansi perbedaan antara data yang diperoleh yang dilanjutkan
dengan uji post hoc Tukey HSD untuk uji Anova. Penelitian ini menggunakan analisis statistika dengan jenis analisis percobaan Anova satu arah. Pada
penelitian, faktor yang mempengaruhi sifat fisik dan stabilitas sediaan gel hanya ada satu faktor yaitu konsentrasi gelling agent.
Tingkat signifikansi yang digunakan yaitu 0,05. Namun apabila hasil kedua uji yang didapat tidak
memenuhi uji statistik parametik tidak terdistribusi normal dan tidak homogen,
maka perhitungan analisis data dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis. Semua perhitungan statistik analisis data secara statistik dilakukan dengan perangkat
lunak R 3.1.2.
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi dan Ekstraksi Daun Mengkudu
Tanaman mengkudu sebagai sampel dalam penelitian diperoleh dari Leses, Manisrenggo, Kabupaten Klaten. Proses determinasi dilakukan di Unit IV
Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta Lampiran 1. Determinasi dilakukan untuk mengetahui kebenaran tanaman yang digunakan dalam
penelitian. Pada lampiran hasil determinasi tersebut dinyatakan bahwa sampel merupakan jenis Morinda citrifolia L. dengan suku Rubiaceae. Morinda citrifolia
L. merupakan nama ilmiah dari tanaman mengkudu.
Gambar 2. Ekstrak kental daun mengkudu
Ekstrak daun mengkudu yang dihasilkan dari proses maserasi, memiliki
warna coklat tua kehitaman dengan bau khas ekstrak. Ekstrak yang dihasilkan
Kategori