Jenis Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Alat Penelitian Analisis Hasil

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan merupakan jenis penelitian eksperimental dengan desain faktorial menggunakan dua faktor dan dua level.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas. Komposisi dan level level rendah dan level tinggi Carbopol ® 940 dan propilen glikol sebagai gelling agent dan humectant . b. Variabel tergantung. 1 Variabel tergantung uji sifat fisik adalah viskositas dan daya sebar. 2 Variabel tergantung uji stabilitas fisik adalah pergeseran viskositas 3 Variabel tergantung uji iritasi primer adalah eritema dan atau edema 4 Variabel tergantung uji aktivitas antimikroba adalah diameter zona hambat c. Variabel pengacau terkendali. 1 Variabel pengacau terkendali uji sifat fisik dan stabilitas fisik terutama adalah jenis dan ukuran mixer, suhu pencampuran, lama pencampuran, kecepatan pencampuran, serta kondisi wadah dan penyimpanan. 2 Variabel pengacau terkendali uji iritasi primer terutama adalah jenis kelinci, kondisi kandang, serta banyaknya dan lama pengaplikasian sediaan. 3 Variabel pengacau terkendali uji aktivitas antimikroba terutama adalah kepadatan suspensi bakteri, diameter lubang sumuran, banyaknya emulgel, suhu dan lama inkubasi. d. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah laju evaporasi minyak daun cengkeh dan kondisi kelinci.

2. Definisi Operasional

a. Emulgel. Emulgel adalah sediaan semisolid hasil emulsifikasi minyak daun cengkeh menggunakan emulsifying agent Tween 80 dan Span 80 dengan penambahan Carbopol ® 940 sebagai gelling agent dan propilen glikol sebagai humectant yang dibuat sesuai prosedur dalam penelitian ini. b. Faktor. Faktor adalah besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian ini digunakan 2 faktor, yaitu Carbopol ® 940 sebagai faktor A dan propilen glikol sebagai faktor B. c. Level. Level adalah nilai atau tetapan untuk faktor, dalam penelitian ini terdapat 2 level, yaitu level rendah dan level tinggi. Level rendah Carbopol ® 940 dinyatakan dalam jumlah 3 g dan level tinggi sebanyak 5 g. Level rendah propilen glikol dinyatakan dalam jumlah sebanyak 3 g dan level tinggi sebanyak 7 g. d. Respon. Respon adalah besaran yang diamati perubahan efeknya, besarnya dapat dikuantitatifkan. Dalam penelitian ini adalah hasil percobaan sifat fisik emulgel daya sebar dan viskositas dan stabilitas emulgel pergeseran viskositas e. Efek. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level dan faktor. f. Daya sebar. Daya sebar adalah diameter penyebaran 1 gram emulgel pada alat uji daya sebar yang diberi beban 50 gram dan didiamkan selama 1 menit. g. Viskositas. Viskositas adalah hambatan emulgel untuk mengalir setelah adanya pemberian gaya. Semakin besar viskositas, maka emulgel semakin tidak mudah untuk mengalir. h. Pergeseran viskositas. Pergeseran viskositas adalah persentase dari selisih viskositas emulgel dalam penyimpanan selama 1 bulan dengan viskositas emulgel setelah dibuat Zatz dan Kushla, 1996.

C. Bahan Penelitian

Minyak daun cengkeh minyak essensial dari daun tanaman cengkeh yang diperoleh dari CV Indaroma Yogyakarta, Carbopol ® 940, Propilen glikol, Tween 80 dan Span 80 sebagai emulsifying agent, parafin cair, Triethanolamine, metil paraben, propil paraben, aquadest, kelinci, Mueller Hinton Agar, Mueller Hinton Broth , kultur bakteri Staphyloccus epidermidis ATCC 12228, Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.

D. Alat Penelitian

Seperangkat alat gelas PYREX, neraca, waterbath, mixer, viskometer RION, stopwatch, alat pengukur daya sebar, seperangkat alat uji iritasi primer, dan seperangkat alat uji potensi emulgel minyak daun cengkeh.

E. Tata Cara Penelitian

1. Identifikasi dan Verifikasi Minyak Daun Cengkeh

Verifikasi minyak daun cengkeh yang dilakukan pada penelitian ini meliputi verifikasi indeks bias minyak daun cengkeh dan bobot jenis minyak daun cengkeh. Indeks bias minyak daun cengkeh diukur menggunakan hand refractometer , sedangkan bobot jenisnya menggunakan piknometer yang telah dikalibrasi. a. Verifikasi indeks bias minyak daun cengkeh. Minyak daun cengkeh diteteskan pada prisma utama kemudian prisma ditutup. Ujung refractometer diarahkan ke cahaya terang agar skala pada lensa dapat dilihat dengan jelas dan ditentukan nilai indeks biasnya. Nilai indeks bias ditunjukkan oleh garis batas yang memisahkan sisi terang dan sisi gelap pada bagian atas dan bawah. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. b. Verifikasi bobot jenis minyak daun cengkeh. Piknometer yang digunakan dikalibrasi terlebih dahulu dengan menetapkan bobot piknometer kosong dan bobot air pada suhu 25 O C. Piknometer diisi minyak daun cengkeh dan suhu dikondisikan pada 25 O C, kemudian piknometer ditimbang. Bobot piknometer yang telah diisi minyak daun cengkeh kemudian dikurangkan dengan bobot piknometer kosong. Perbandingan antara bobot minyak daun cengkeh dengan bobot air dalam pinkometer pada suhu 25 O C merupakan bobot jenis minyak daun cengkeh. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

2. Pembuatan emulgel dengan kombinasi komposisi Carbopol

® 940 dan Propilen Glikol Formula yang digunakan mengacu pada formula hasil penelitian Suryarini, 2011, dengan formula untuk 250 gram emulgel: R Minyak cengkeh Carbopol ® 940 NaOH 20 bv Parafin cair Tween 80 Span 80 Gliserin Metil paraben Propil paraben Aquadest 37,5g 5 g 1,5 g 2,5 g 43,75g 6,25 g 5 g 0,45 g 0,05 g 135,5 g Komposisi formula baru setelah dimodifikasi: Tabel VI. Formula Optimasi Emulgel Minyak daun cengkeh 200 g Emulgel Formula Bahan 1 a b Ab Minyak cengkeh 30 30 30 30 Carbopol ® 940 3 5 3 5 Propilen glikol 3 3 7 7 Tween 80 35 35 35 35 Span 80 5 5 5 5 TEA 1,6 1,6 1,6 1,6 Parafin cair 2 2 2 2 Metil paraben 0,36 0,36 0,36 0,36 Propil paraben 0,04 0,04 0,04 0,04 Aquadest 117 117 117 117 Cara pembuatan emulgel minyak daun cengkeh : Carbopol ® 940 dikembangkan dengan menggunakan 70 mL aquades dari formula selama 24 jam, kemudian semua bahan yang termasuk dalam fase minyak, yaitu minyak daun cengkeh, parafin cair, Span 80, dan propil paraben dicampur terlebih dahulu. Pada wadah yang berbeda, semua bahan yang termasuk fase air, yaitu Tween 80, metil paraben, propilen glikol, dan sisa aquades dicampurkan. Fase minyak dan fase air tersebut dicampurkan dengan kecepatan mixer pada skala 1 selama 10 menit pada suhu 50 C. Selanjutnya, emulsi dicampurkan ke dalam Carbopol ® 940 yang sebelumnya telah dikembangkan dengan aquades dari formula dengan kecepatan putar mixer pada skala 1 selama 10 menit. TEA ditambahkan ke dalam campuran, lalu campuran diaduk kembali menggunakan mixer kecepatan skala 1 selama 5 menit.

3. Uji pH

pH sediaan diuji dengan universal pH indicator yang memiliki skala 1-14. Pembacaan hasil pengujian dilihat dari warna yang terjadi pada pH stick dan dibandingkan dengan skala warna pada wadah universal pH indicator.

4. Uji Iritasi Primer

Punggung kelinci dicukur 24 jam sebelum pengaplikasian sampel. Kemudian bagian punggung yang sudah dicukur dibagi menjadi lima area masing-masing 2,54 x 2,54 cm. Tiga area untuk mengoleskan masing-masing 0,5 gram 3 replikasi sediaan, satu area untuk basis sediaan, dan satu yang lain dibiarkan kosong tanpa perlakuan sebagai pembanding. Selanjutnya punggung kelinci ditutup kasa, diamati setelah 24 jam, dan diulangi pada 72 jam setelah aplikasi. Reaksi didefinisikan sebagai eritema dan edema berdasarkan evaluasi sesuai dengan sistem penilaian untuk reaksi kulit Kamkaen, Phuntuwate, Samee, Boonrod, and Treesak, 2007.

5. Uji sifat fisik sediaan emulgel minyak daun cengkeh

Sifat fisik emulgel minyak daun cengkeh yang diuji pada penelitian ini meliputi: a. Uji Viskositas. Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscotester Rion seri VT-04 dengan cara: sediaan emulgel dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Viskositas emulgel diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Viskositas yang dikehendaki dalam penelitian ini antara 200 – 300 d.Pa.s. Pengujian viskositas dilakukan dalam dua periode, 48 jam setelah emulgel selesai dibuat dan setelah penyimpanan selama 1 bulan untuk mengetahui persen pergeseran viskositas. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. b. Uji daya sebar. Cara pengujian daya sebar: sediaan emulgel ditimbang seberat 1 gram dan diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di atas emulgel diletakkan beban 50 gram, didiamkan 1 menit, kemudian dicatat penyebarannya. Daya sebar yang dikehendaki adalah 3 – 5 cm. Pengujian daya sebar dilakukan pada 48 jam setelah pembuatan dengan replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

6. Uji potensi antibakteri emulgel minyak daun cengkeh

Tiga ose kultur bakteri Staphylococcus epidermidis dimasukkan kedalam tabung berisi 10 mL media Mueller Hinton Broth dan diinkubasi selama 48 jam hingga kekeruhannya sama dengan Mac Farland 0,5. Dari bakteri dalam media Mueller Hinton Broth tersebut diambil 1 mL dan ditanamkan dalam 30 mL media Mueller Hinton Agar pada cawan petri secara pour plate . Pada media Mueller Hinton Agar yang telah memadat, dibuat 5 buah lubang dengan diameter masing-masing 8 mm. Empat buah lubang digunakan untuk meletakkan emulgel dan satu lagi sebagai kontrol negatif yaitu basis. Media diinkubasi pada inkubator selama 48 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengukur zona hambat yang dinyatakan dengan zona bening di sekitar sediaan.

F. Analisis Hasil

Pada penelitian ini akan diperoleh beberapa data, yaitu: data sifat fisik emulgel meliputi viskositas dan daya sebar emulgel, stabilitas emulgel yang dilihat dari pergeseran viskositasnya, iritasi primer, pH, serta daya hambat emulgel pada Staphylococcus epidermidis. Untuk melihat pengaruh komposisi gelling agent dan humectant Carbopol ® 940 dan propilen glikol terhadap sifat fisik emulgel meliputi daya sebar dan viskositas, serta stabilitasnya pergeseran viskositas dianalisis menggunakan desain faktorial. Respon untuk setiap kombinasi formula yang diperoleh dari hasil uji sifat fisik emulgel digunakan untuk menghitung persamaan desain faktorial: Y = b o + b 1 X A + b 2 X B + b 12 X A X B Keterangan: Y = Respon hasil percobaan yang diamati X A = Level faktor A Carbopol ® 940 X B = Level faktor B Propilen glikol X A X B = Level faktor A dikalikan level faktor B b o = Rata-rata hasil semua percobaan b 1 , b 2 , b 12 = Koefisien yang dapat dihitung dari hasil percobaan Jika model persamaan tersebut valid, maka dari persamaan tersebut dapat dibuat suatu contour plot dan contour plot superimposed untuk menentukan area optimum. Desain faktorial digunakan untuk menentukan faktor mana yang dominan dalam menentukan sifat fisik dan stabilitas emulgel. Program yang digunakan untuk mengolah data secara statistik adalah program R 12.4.1. Apabila data yang diperoleh memenuhi persyaratan uji parametrik, maka analisis data pengujian hipotesis untuk melihat pengaruh faktor terhadap sifat fisik dan stabilitas sediaan emulgel menggunakan ANOVA. Persyaratan uji parametrik adalah distribusi data yang normal p0,05 yang diuji menggunakan uji Shapiro-wilk, memiliki kesamaan varian yang dinyatakan dengan p0,05 diuji dengan Levene’s Test, dan uji signifikan persamaan memberikan nilai p0,05. Jika data yang diperoleh tidak memenuhi persyaratan uji parametrik maka analisisnya menggunakan kruskal-wallis. Dari uji ANOVA dapat diketahui signifikansi efek Carbopol ® 940, propilen glikol, dan kemungkinan interaksi keduanya, serta dapat diketahui faktor yang dominan memberikan pengaruh pada setiap sifat fisik dan stabilitas emulgel. Signifikansi dinyatakan dengan nilai p0.05. Untuk mengetahui potensi antibakteri emulgel digunakan Wilcoxon Two Sample karena keempat formula emulgel dalam penelitian memiliki konsentrasi minyak daun cengkeh yang berbeda sehingga tidak dapat dibandingan potensi antibakteri antar-formula. Masing-masing formula dibandingkan potensi antibakterinya dengan basis yang merupakan kontrol negatif. Berbeda dengan kedua hal tersebut, untuk menganalisis hasil uji iritasi primer digunakan tabel evaluasi edema dan eritema, kemudian ditentukan kategori iritasi primernya.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi dan Verifikasi Minyak Daun Cengkeh

Minyak daun cengkeh yang digunakan pada penelitian ini merupakan minyak daun cengkeh yang berasal dari CV. Indaroma, Yogyakarta dengan kadar eugenol 74,08. Telah dilakukan uji identifikasi yang dibuktikan dengan Certificate of Analysis CoA yang terlampir di Lampiran 1. Verifikasi ulang yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pemeriksaan terhadap indeks bias dan bobot jenis untuk memastikan kebenaran identitas minyak daun cengkeh yang diguanakan. Tabel VII. Perbandingan Hasil Pengukuran Indeks Bias dan Bobot Jenis Minyak Daun Cengkeh dengan CoA dan Literatur Sifat Fisik USPC Inc., 1995 CoA Hasil Verifikasi Indeks Bias 1,530 1,520 – 1,540 1,534 ± 0,001 Bobot Jenis 1,035 – 1,060 gL 1,010 – 1,035 1,0207±0,002 Dari hasil yang diperoleh tersebut, diketahui bahwa indeks bias dan bobot jenis minyak daun cengkeh yang digunakan masuk dalam range Certificate of Analysis yang dilampirkan, tetapi tidak masuk dalam range secara teoretis berdasarkan United State Pharmacopheia: The National Formulary 1995. Hal ini dapat disebabkan karena perbedaan tempat tumbuh dan kondisi iklim yang mempengaruhi jumlah dan macam-macam kandungan senyawa minyak cengkeh yang diuji dengan minyak cengkeh yang terdapat pada literatur.