Preparasi Alat Proses Enkapsulasi Bakteri Perhitungan Sel Bakteri dalam Mikrokapsul

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4 Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang akan dilakukan adalah sebagai berikut:

3.4.1 Preparasi Alat

Semua peralatan gelas yang akan digunakan dalam penelitian disterilkan. Proses sterilisasi terlampir lampiran 2.

3.4.2 Preparasi Bakteri Lactobacillus casei

3.4.2.1 Pembuatan Medium MRS Broth DeMan Rogosa Sharpe

Sejumlah 52 gram serbuk MRS ditimbang dan kemudian dilarutkan dalam 1 liter air destilasi dan dipanaskan sampai melarut pada suhu 60 ⁰C. Lalu media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 ⁰C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah dikeluarkan dari autoklaf, media didiamkan beberapa saat Oxoid, 1998.

3.4.2.2 Pembuatan Medium Agar MRS DeMan Rogosa Sharpe

Sejumlah 62 gram serbuk MRS ditimbang dan kemudian dilarutkan dalam 1 liter air destilasi dan dipanaskan sampai melarut. Lalu media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 ⁰C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah dikeluarkan dari autoklaf, media didiamkan beberapa saat Oxoid, 1998.

3.4.2.3 Peremajaan Biakan Murni Bakteri Lactobacillus casei

Peremajaan biakan murni bakteri Lactobacillus casei pada media agar MRS yaitu dilakukan dengan menggoreskan satu ose yang telah mengandung bakteri Lactobacillus casei secara zigzag pada media agar MRS, kemudian tabung media ditutup dengan kapas. Selanjutnya, biakan bakteri Lactobacillus casei diinkubasi pada suhu 37 ⁰C dalam inkubator selama 24 - 48 jam sehingga didapatkan bakteri stock. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.2.4 Pewarnaan Bakteri

Bakteri Lactobacillus casei merupakan bakteri gram positif, maka untuk melakukan pewarnaan bakteri gram positif dilakukan dengan cara sebagai berikut : a. Sediaan yang sudah dikerat diwarnai dengan karbol kristal ungu selama satu menit. Bakteri akan berwarna ungu, karena zat warna diserap dalam sel dan protoplasma. b. Zat warna dibuang dan diganti dengan larutan lugol larutan I2+KI dibiarkan selama 45-60 detik. Pemberian lugol menyebabkan terbentuknya komplek ungu kristal- iodium yang berwarna ungu tengguli kotor. c. Larutan lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan alkohol 96 selama 30 detik atau digoyang-goyangkan sampai tidak ada zat warna yang mengalir lagi. Pencucian dengan alkohol menyebabkan terjadinya diferensiasi dari dua macam kuman : a Kuman tetap berwarna ungu. b Kuman tidak berwarna, sebab zat warna dilarutkan oleh alkohol dan keluar dari sel kuman. d. Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan air- fukhsin selama 1-2 menit. Sediaan dicuci, dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop. Fukhsin sebagai pewarna kontras counter-stain mewarnai kuman yang tidak berwarna menjadi warna merah. e. Hasil dapat dibaca sebagai berikut : a Kuman gram positif berwarna ungu. b Kuman gram negatif berwarna merah Staf Pengajar FKUI, 1994. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.3 Preparasi Proses Enkapsulasi

3.4.3.1 Pembuatan Suspensi Bakteri

Diambil satu ose kultur stock Lactobacillus casei diinokulasi pada 10 mL medium MRS Broth. Bakteri diinkubasi dalam medium MRS Broth selama 24 jam pada suhu 37 ⁰C. Setelah itu, bakteri tersebut dipindahkan dalam 100 mL MRS Broth dan diinkubasi kembali pada kondisi yang sama Betha, 2014 ―dengan modifikasi‖. Kemudian bakteri dipanen dengan cara disentrifugasi pada 4400 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ⁰C. Kemudian, supernatan dibuang dan endapan sel dicuci dua kali dengan larutan NaCl fisiologis steril 0,9, sehingga didapatkan suspensi bakteri L.casei Mandal, S., A. K. Puniya, K. Singh, 2006. Perhitungan sel bakteri menggunakan metode plate count. Bakteri yang telah dicuci dua kali dengan NaCl fisiologis, kemudian diambil sebanyak 100 μL dan disebarkan pada media MRS agar. Setelah itu, diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 ⁰C Woraharn, Sasimar dkk, 2010. Jumlah bakteri dihitung dengan rumus : Cfuml = rata-rata total koloni volume yang disebar ke cawan petri x faktor pengenceran

3.4.3.2 Pembuatan Larutan Matriks Kappa Karagenan

Untuk membuat larutan kappa karagenan, ditimbang kappa karagenan sebanyak 1 gram; 0,875 gram dan 0,75 gram. Setelah itu, ditambahkan NaCl fisiologis 0,9 sebanyak 40 mL ke dalam kappa karagenan yang telah ditimbang, kemudian dipanaskan pada suhu 37 ⁰-60⁰C sampai didapatkan larutan gel kappa karagenan. Tsen, Jen-Horng, Yeu-Pyng Lin, V. An-Erl King, 2003; Dinakar

P, Mistry VV dan J Dairy, 1994.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.4 Proses Enkapsulasi Bakteri

Sebanyak 10 mL suspensi sel L.casei dan 40 mL larutan kappa karagenan dicampurkan pada suhu ± 40 ⁰C, sehingga didapatkan suspensi kappa karagenan dengan konsentrasi akhir 2, 1,75 dan 1,5. Kemudian suspensi dimasukkan ke dalam syringe dan ditekan untuk membentuk mikrokapsul. Mikrokapsul ditampung dalam larutan KCl steril 0,3 M King dan Zall, 1983; Cassidy dkk, 1997 dalam Tsen Jen-Horng, Yeu-Pyng Lin, V. An-Erl King, 2003. Mikrokapsul disimpan dalam larutan KCl 0,3 M pada suhu 10 ⁰C selama 2 jam Tsen Jen-Horng, dkk, 2003. Mikrokapsul yang terbentuk kemudian disaring dan dibilas dengan NaCl steril 0,9.

3.4.5 Perhitungan Sel Bakteri dalam Mikrokapsul

Sebanyak 1 gram mikrokapsul setiap konsentrasi 2, 1,75 dan 1,5 disuspensikan kembali dalam 9 mL NaCl fisiologis dengan distirer selama 20 –25 menit hingga polimer mikrokapsul pecah dan campuran berwarna kekeruhan, kemudian divortex sampai homogen. Campuran homogen dibuat beberapa pengenceran yang tepat, menggunakan NaCl 0,9. Kemudian enumerasi bakteri dilakukan dengan cara mengambil 100 μL hasil pengenceran disebarkan pada media MRS agar Sohail, Asma dkk, 2010. Setelah itu, diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 ⁰C Woraharn, Sasimar dkk, 2010. Sampel dilakukan triplo. Total koloni dihitung dengan metode plate count dan kepadatan bakteri setiap 1 gram mikrokapsul yang terbentuk cfugram M.J. Martin, 2013 dihitung dengan rumus : Cfugram= rata-rata total koloni volume yang disebar ke cawan petri x faktor pengenceran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Efisiensi persen penjerapan bakteri dari matriks kappa karagenan dapat diperkirakan dengan rumus Ardianto, Ari, 2011 : P = populasi L.casei per gram mikrokapsul cfugram mikrokapsul Q = massa mikrokapsul yang dihasilkan dari total suspensi biopolimer-sel yang digunakan gram R = total L.casei didalam suspensi biopolimer-sel cfu

3.4.6 Pengukuran Viskositas dan Diameter Mikrokapsul