Prosedur Penelitian Tahap I 1.
Isolasi dan Karakteristik BAL Asal Ayam Kampung
BAL diisolasi dari berbagai segmen pada saluran pencernaan ayam kampung yaitu pada proventriculus, ventriculus, yeyenum, ileum, usus besar dan cecum. Isolasi dilakukan
dengan mensuspensikan 1 gram dari masing-masing saluran pencernaan ayam kampung kedalam 100 ml larutan NaCl 0,85 secara aseptis. Kemudian dibuat pengenceran 10
-2
–10
7
. Sebanyak 1 mL hasil pengenceran tadi kemudian diinokulasikan pada medium MRSA
Man Ragosa Sharpe Agar yang mengandung CaCO3 1 kemudian diinkubasikan pada suhu 37
Setiap koloni yang terbentuk diamati dan diidentifikasi berdasarkan morfologi, reaksi pengecatan gram, pembentukan gas, pengujian katalase kemudian penamaan taksonomi
dilakukan menggunakan Bergey’s manual of Determinative Bacteriology Buchanan and Gibbons, 1974. Masing-masing koloni yang teridentifikasi ditumbuhkan kembali dalam
medium MRSB. Inkubasi pertumbuhan BAL dilakukan pada suhu 37 C selama 48 jam. Koloni yang menunjukkan zona bening disekitar koloni
menunjukkan bahwa koloni tersebut adalah bakteri asam laktat BAL.
o
Koloni yang terpisah dengan bentuk dan ukuran yang berbeda diambil menggunakan jarum ose steril dan digoreskan pada MRSA yang telah beku dan diinkubasi pada kondisi
yang sama membentuk goresan kuadran. Penggoresan dilakukan sampai diperoleh koloni yang seragam. Koloni yang murni dipilih, lalu dilakukan pewarnaan gram dan uji katalase.
C selama 48 jam.
2. KarakteristikBAL Berdasarkan Morfologi
Tahap awal pemurnian dimulai dengan memilih koloni tunggal yang tumbuh pada medium MRSA setelah diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya mengambil koloni tunggal
pada kultur, kemudian diinokulasikan secara goresan pada medium MRSA dan diinkubasi pada temperatur 37
C selama 48 jam. Koloni dari kultur murni selanjutnya diamati morfologinya. Identifikasi isolat BAL berdasarkan bentuk coccus, rod-shape,
coccobacillus dan penataan bentuk tunggal, berpasangan, rantai dilakukan dengan pengamatan menggunakan mikroskop Buchanan and Gibbons, 1974.
3. KarakteristikBAL BerdasarkanReaksi Pewarnaan Gram
Prosedur pewarnaan mengikuti metode Djide dan Sartini, 2008
,
dalam Trisna 2012, biakan bakteri diambil dari stok dan diratakan diatas preparat yang telah dibersihkan
menggunakan etanol 70. Kemudian difiksasi diatas api bunsen lalu ditetesi dengan zat warna kristal violet selama 1 menit agar zat warna meresap pada bakteri. Preparat kemudian
dibilas dengan aquades mengalir dan ditetesi dengan larutan iodine kompleks. Kemudian ditunggu selama 1 menit lalu dibilas dengan aquades mengalir. Preparat dicuci dengan
alkohol asam. Kemudian ditetesi dengan zat warna safranin, lalu ditunggu 30 detik. Setelah itu dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi.
4. Karakteristik BAL Berdasarkan Uji Motilitas
Sebanyak 1 ose isolat diambil dari stok kemudian diinokulasikan dengan cara ditusuk pada medium SIM tegak. Selanjutnya diinkubasi pada temperatur 37
C selama 48 jam. Hasil positif motil jika terdapat rambatan – rambatan disekitar bekas tusukan jarum pada
medium dan hasil negatif non motil bila tidak terdapat rambatan-rambatan disekitar bekas tusukan jarum ose pada medium.
5. Karakteristik BAL Berdasarkan Uji Katalase
Sebanyak 2 tetes larutan hidrogen peroksida H
2
O
2
3 diteteskan pada gelas obyek bersih, kemudian ditambahkan inokulum BAL. Uji positif ditandai denganterbentuknya
gelembung oksigen dan uji negatif tidak adanya gelembung gas isolat tidak tumbuh Madigan et al., 2003.
6. Uji Ketahanan BAL terhadap Keasaman Lambung pH, Garam Empedu dan Suhu
