Penentuan Jumlah Koloni BAL Uji Daya Hambat BAL terhadap Bakteri E.coli

7. Penentuan Jumlah Koloni BAL

Jumlah koloni BAL dari isolat diukur menggunakan metode Total Plate Count TPC Fardiaz, 1992. Sebanyak 1 g isolat hasil sentrifugassi dimasukkan ke petri dalam 9 ml NaCl fisiologis 0.85, lalu diencerkan sampai pengenceran 7 kali secara serial. Sebanyak 0,1 ml dari pengenceran 6 dan 7 kali ditanam pada cawan petri berisi media MRS agar. Media agar yang ditanam kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Koloni yang tumbuh berbentuk bulat miring berwarna agak kekuningan. Kemudian dihitung sebagai beirikut: Populasi BAL cfug = Jumlah koloni X Pengenceran

8. Uji Daya Hambat BAL terhadap Bakteri E.coli

a. Isolasi Bakteri Uji E.coli Sampel feses segar dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi NaCl fisiologis 10 ml. Diambil 1 tetes feses yang sudah dihomogenkan dengan larutan NaCl fisiologis. Sebanyak 15 ml media Eosin Methylene Blue EMB dimasukkan ke dalam cawan petri untuk disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Setelah sterilisasi media diambil dari strerilisator untuk selanjutnya didiamkan pada suhu kamar agar media menjadi padat. Dari pengenceran sampel yang dikehendaki, sebanyak 0,1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam cawan petri dengan metode sebar menggunakan gelas bengkok. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 18-24 jam. Setelah akhir inkubasi, koloni yang tumbuh dan berwarna hijau metalik dengan titik hitam pada bagian tengahnya dihitung sebagai koloni E. coli. Koloni yang tumbuh dikoleksi dengan cara diinokulasikan pada media nutrien agar NA miring untuk pemeriksaan selanjutnya. b. Uji Daya Hambat BAL terhadap E.coli Untuk mengetahui bahwa isolat bakteri mempunyai potensi yang bagus sebagai bakteri BAL maka perlu dilakukan uji daya hambat terhadap bakteri patogen. Bakteri patogen yang digunakan adalah E.coli bakteri gram negatif.Untuk perlakuan kontrol positif digunakan kertas cakram yang telah berisi antibiotika amoksilin, karena kloramfenikol memiliki sensitivitas yang sangat tinggi, dimana pada dosis 30 μgkertas cakram mampu menghasilkan diameter zona hambat sebesar 25-31 mm Fardiaz, 1992. Langkah awal yang dilakukan adalah menginokulasi 1 ose ose bulat isolat dari stok kultur pada medium MRSA miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Hal yang sama dilakukan terhadap bakteri uji E. coli yang diinokulasikan pada medium NAmiring dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C. Sebanyak 1 ml isolat E. coli diinokulasikan pada medium NA dengan metode tuang sebanyak 20 ml dan dibiarkan memadat membentuk ketebalan agar. Campuran dihomogenkan dengan cara cawan petri digerakkan membentuk angka delapan diatas bidang datar. Sementara itu disiapkan kertas cakram steril lalu direndam seban yak 10 μl dalam masing-masing suspensi isolat BAL selama 10 menit. Kemudian kertas cakram diletakkan di permukaan medium NA yang telah memadat, lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C untuk memberikan kesempatan supernatan beraktivitas terhadap bakteri uji. Zona bening yang terbentuk menunjukkan adanya hambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji oleh supernatan. Diameter zona bening mm diukur dengan jangka sorong sebanyak tiga kali pada posisi yang berbeda dan dirata- ratakan. Diameter Zona Bening mm 2 V ml = LZ –LS Keterangan: LZ : Luas zona bening mm 2 LS : Luas sumur mm 2 V : Volume contoh ml

9. Pengukuran Total Asam Tertitrasi