Waktu dan Tempat Isolasi Bakteri Endofit dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L.

Gustin Khairani : Isolasi Dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA Indole Acetic Acid Dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L., 2010. BAB 3 BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2008 sampai September 2009 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU Medan dan Laboratorium Kimia Kuantitatif Fakultas Farmasi USU Medan. 3.2 Bahan Bahan yang digunakan adalah akar tanaman jagung yang sehat dan berumur kurang lebih 80 sampai 110 hari. Akar tanaman jagung diperoleh dari 2 lokasi perladangan jagung yaitu kebun jagung daerah Medan dan kebun jagung daerah Binjai serta kecambah jagung, triptofan, reagen salkowski dan media LB Luria Bertani Lampiran A. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Isolasi bakteri endofit dari akar tanaman jagung Zea mays L. Dengan Metode Radu Kqueen 2002 Gustin Khairani : Isolasi Dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA Indole Acetic Acid Dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L., 2010. Akar tanaman jagung dari kedua lokasi segera dicuci dengan air untuk menghilangkan kotoran yang menempel di permukaan akar. Akar selanjutnya dikeringkan, dibungkus dengan kertas koran dan dimasukkan kedalam kantong plastik, dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU. Tahap awal isolasi adalah mencuci bagian akar tanaman 3-5 cm dengan air mengalir selama 20 menit. Kemudian disterilisasikan bagian permukaan akar tanaman dengan merendamnya secara berturut- turut dalam larutan etanol 75 selama 2 menit, larutan sodium hipoklorit 5,3 selama 5 menit, dan etanol 75 selama 30 detik. Selanjutnya, akar dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Setelah kering, bagian ujung kiri dan kanan akar tanaman dibuang ± 1 cm. Kemudian masing- masing akar dipotong menjadi 4 bagian dan diletakkan pada permukaan media NA yang telah dicampurkan dengan antibiotik ketokonazol 0,3 gram 100 ml dengan posisi bekas potongan kearah media. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang 25º- 30ºC selama ±1 hari. Koloni yang muncul dari bagian akar tanaman sebelah dalam disubkulturkan ke media NA yang baru sampai didapat biakan murni. Isolat murni yang diperoleh dikarakterisasi morfologinya dengan pewarnaan gram serta uji biokimia metabolisme bakteri seperti uji sitrat, uji gelatin, uji motilitas, uji sulfida, uji katalase dan uji hidrolisis pati Lay, 1994.

3.3.2 Penentuan Kurva Standart IAA Aryantha et al., 2004 yang dimodifikasi.

IAA sintesis ditimbang sebanyak 0,001 gram dan dilarutkan kedalam 100 ml akuades. IAA sintesis masing-masing dibagi ke dalam tabung yang berbeda dengan konsentrasi 0 ppm; 0,2 ppm sampai 2 ppm. Setiap tabung yang berisi konsetrasi IAA yang berbeda ditambahkan akuades hingga mencapai 3 ml. Masing-masing konsentrasi ditambahkan 1 ml pereaksi Salkowski Lampiran D; Gambar 4 kemudian dihomogenkan dan absorbansinya diukur dengan spektrofotometer UV-Visible Shimadzu 1240 dengan panjang gelombang 530 nm Lampiran B.

3.3.3 Kemampuan bakteri endofit akar dalam menghasilkan IAA secara in vitro.

14 Gustin Khairani : Isolasi Dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA Indole Acetic Acid Dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L., 2010. Untuk mengetahui kemampuan bakteri endofit dalam menghasilkan IAA secara in vitro, pertama isolat bakteri endofit yang telah murni diremajakan ke media NA Nutrient Agar dan diinkubasi selama 48 jam. Kemudian isolat muda tersebut dibuat suspensi sebanyak 10 ml dengan standar Mac Farland sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel 10 8 CFUml Bresson Borges, 2003. Suspensi biakan bakteri diambil sebanyak 3 ml dan dimasukkan ke dalam 30 ml media LB cair Luria Bertani + tryptofan Bric et al., 1991. Masing- masing perlakuan dilakukan 3 kali ulangan dan diinkubasi pada suhu 28 C selama 7 hari di dalam shaker dengan kecepatan 150 rpm Ahmad et al., 2004. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 25 menit, diperoleh supernatan dan pellet. Analisis kadar IAA menggunakan metode Kolorimetri. Supernatan diambil sebanyak 2 ml ditambah salkowsky reagent 1 ml Gordon Weber, 1997 atau dengan perbandingan 2: 1 Zahir et al., 1997. Didiamkan selama 60 menit, diukur absorbansinya dengan spektofotometer 530 nm. Persamaan regresi disubstitusikan dengan nilai absorbansi sampel.

3.3.4 Pengukuran Pertumbuhan Sel Bakteri Endofit

Pengukuran pertumbuhan sel dilakukan dengan metode standart plate count. Pengukuran pertumbuhan sel diamati setiap dua hari sekali yaitu pada masa inkubasi hari ke-0, hari ke-2, hari ke-4, dan hari ke-6. 1 ml media pertumbuhan biakan Luria bertani diencerkan hingga mencapai konsentrasi 10 -7 , kemudian diinokulasikan ke media plate count agar dengan metode cawan sebar dan diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung dengan Counter Coulter. Perhitungan estimasi jumlah sel dapat dihitung dengan rumus: Estimasi jumlah sel = Jumlah koloni X 1 CFUml Faktor Pengenceran Fardiaz, 1992

3.3.5 Introduksi Bakteri Endofit Pada Kecambah Tanaman Jagung.

Bakteri yang diintroduksikan adalah bakteri yang mampu menghasilkan IAA dengan konsentrasi tertinggi pada hari ke-2, hari ke-4 dan hari ke-6. Kecambah tanaman jagung umur 3 hari disterilkan dengan cara direndam dalam larutan sodium hipoklorit 15 Gustin Khairani : Isolasi Dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA Indole Acetic Acid Dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L., 2010. 5,3 selama ± 1 menit, kemudian dibilas dengan akuades steril, lalu direndam dalam etanol 70 selama ± 5 detik dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali Suryowinoto, 1996. Kecambah tanaman jagung dicelupkan kedalam suspensi bakteri endofit yang telah setara dengan Mc Farland 10 8 CFUml selama 2 jam. Kecambah ditanam pada tanah steril, kecambah yang tidak direndam digunakan sebagai kontrol, dilakukan 3 kali ulangan untuk masing- masing perlakuan. Pengamatan dilakukan selama 2 minggu dengan mengukur tinggi kecambah, panjang akar kecambah dan berat kecambah. Pengukuran tinggi kecambah dilakukan dengan batas terbawah bagian batang yang tepat pada permukaan tanah, dan batas teratas dihitung hingga ujung daun yang diluruskan ke atas sejajar batang. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Bakteri Endofit dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L.

Isolasi bakteri endofit penghasil IAA dari akar tanaman jagung Zea Mays L. dari 2 lokasi diperoleh sebanyak 13 isolat Lampiran D; Gambar 1 2. Sebanyak 10 isolat diperoleh dari kebun jagung daerah Medan dan 3 isolat dari kebun jagung daerah Binjai, hal ini diduga karena perbedaan kondisi lingkungan, jenis tanaman inang dan keadaan tanaman inang ketika pengisolasian. Tanaman jagung pada daerah medan merupakan tanaman yang telah dipanen sementara tanaman jagung pada daerah Binjai masih akan dipanen. Sehingga, terdapat perbedaan umur antara kedua tanaman jagung tersebut. Semakin tua umur tanaman akan semakin memperkaya jumlah bakteri endofit yang berada dalam jaringan tanaman. Ketiga belas isolat ini memperlihatkan karakteristik yang bervariasi baik morfologi maupun sifat pewarnaannya. Bentuk koloni isolat didominasi oleh bentuk circular bulat dan berwarna putih, selebihnya berbentuk rhizoid akar dan irregular tidak beraturan. Tepi koloni sangat bervariasi dengan tipe entire cembung, Gustin Khairani : Isolasi Dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA Indole Acetic Acid Dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L., 2010. filamentous, undulate rata, dan lobate. Elevasi koloni juga bervariasi dengan tipe elevasi raised, convex cembung, flat rata, dan umbonate melengkung. Sedangkan karakterisasi dengan pewarnaan gram sel bakteri menggunakan zat warna kristal violet dan safranin, diperoleh 8 isolat bersifat gram positif dan 5 isolat bersifat gram negatif dengan bentuk koloni didominasi oleh coccus. Hasil pengamatan morfologi koloni dan sel serta gram bakteri penghasil IAA dapat dilihat pada Tabel 4.1.1. Bentuk umum mikroba terdiri dari satu sel uniselluler, bentuk lain berupa koloni yaitu gabungan dua sel atau lebih di dalam satu ruang. Bentuk itu merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu.Variasi bentuk pada sel bakteri adalah bulat kokus, batang bulat memanjang basil dan lengkung. Dari bentuk dasar ini selanjutnya akan terbagi bedasarkan penataannya. Variasi bentuk yang kemudian terjadi baik secara tetap ataupun sebagai bentuk kelainan karena pengaruh lingkungan. Bentuk bakteri juga dapat dipengaruhi oleh umur dan syarat pertumbuhan tertentu. Bahkan akibat pengaruh lingkungan yang tidak menguntungkan, faktor makanan, dan suhu, bakteri dapat mengalami bentuk involusi yaitu bentuk sementara yang terjadi karena lingkungan tidak menguntungkan Ilyas, 2001. Menurut Lay 1994, Pewarnaan gram berguna untuk membedakan gram positif dan gram negatif. Perbedaan hasil pewarnaan disebabkan oleh adanya perbedaan struktur kedua kelompok bakteri tersebut sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri gram positif terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram negatif terdiri dari kandungan lipida yang tinggi dibandingkan gram positif. Tabel 4.1.1 Morfologi koloni dan sel serta sifat pewarnaan gram isolat bakteri endofit akar tanaman jagung. Karakterisasi Isolat Morfologi Koloni Gram Morfologi Sel Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk Penataan KB1 Circular Entire Raised Putih bening + Kokus mono, diplo KB2 Circular Entire Convex Ungu + Basil Tetra KB3 Rhizoid Filamentous Flat Putih + Basil Tetra KB4 Rhizoid Filamentous Umbonate Putih - Kokus mono, diplo 17 Gustin Khairani : Isolasi Dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA Indole Acetic Acid Dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L., 2010. KB5 Irregular Undulate Convex Putih - Kokus mono, diplo KB6 Circular Undulate Convex Putih + Kokus Tetra KB7 Rhizoid Lobate Umbonate Putih + Kokus mono, diplo KB8 Circular Entire Flat Putih bening - Kokus Tetra KB9 Circular Entire Convex Putih bening - Kokus Tetra KB10 Irregular Lobate Flat Putih + Kokus mono, diplo BA1 Irregular Undulate Raised Putih keabu-abuan + Basil Tetra BA2 Irregular Undulate Flat Putih kecoklatan - Basil mono, diplo BA3 Circular Entire Raised Merah bata + Basil mono, diplo Keterangan: KB : Isolat asal daerah Medan BA : Isolat asal daerah Binjai Pada uji gelatin, katalase dan sulfida keretakan, keseluruhan isolat memberikan hasil uji negatif. Sebaliknya, uji motilitas pergerakan semuanya positif. Untuk uji sitrat dan hidrolisis pati hasilnya bervariasi. Pada uji Sulfida yaitu fermentasi glukosa menghasilkan rata- rata uji positif kecuali KB2 dan KB9. Sedangkan fermentasi sukrosa dan laktosa sebaliknya menghasilkan uji negatif kecuali KB4, KB5, dan BA3. Hasil karakterisasi biokimia bakteri endofit penghasil IAA dapat dilihat pada Tabel 4.1.2. Lampiran D; Gambar 3. Tabel 4.1.2 Karakteristik biokimia bakteri endofit penghasil IAA. Uji Biokimia No. Isolat Sulfida S it rat Ge lat in M ot ilit as Hid rol is a P at i K at al as e Glu k os a Sukr os a L ak tos a E ndap an K eret ak an 1. KB1 - - + + - + - - - - 2. KB2 - - + - - - - - + - 3. KB3 + - + + - + - - - - 4. KB4 + - + - - + + + - - 5. KB5 + - + - - + + + - - 6. KB6 - - + + - + - - - - 7. KB7 + - + + - + - - - - 8. KB8 + - + - - + - - - - 9. KB9 + - + + - - - - - - 10. KB10 - - + + - + - - - - 11. BA1 - - + + - + - - - - 12. BA 2 + - + - - + - - + - 13. BA 3 - - + - - + + + - - 18 Gustin Khairani : Isolasi Dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit Penghasil Hormon IAA Indole Acetic Acid Dari Akar Tanaman Jagung Zea mays L., 2010. Menurut Lay 1994, mikroorganisme tumbuh dan berkembangbiak dengan menggunakan berbagai bahan yang terdapat dalam lingkungannya. Zat hara yang terdapat disekelilingnya terdiri dari molekul sederhana seperti H 2 S dan NH 4 + atau molekul organik yang kompleks seperti protein dan disakarida. Penggunaan zat hara tergantung aktivitas metabolism mikroba. Metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Pengamatan aktivitas metabolism ini diketahuai dari kemampuannya untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti zat pati, lemak, protein, asam nukleat, asam amino dan sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian dan identifikasi mikroorganisme.

4.2. Kemampuan bakteri endofit akar dalam menghasilkan hormon IAA secara in vitro.