17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
encer, larutan tersebut akan terbentuk warna merah muda sampai violet. Reaksi ini disebut reaksi biuret sebab warna senyawa yang
terbentuk sama dengan warna senyawa biuret bila di tambahkan larutan natrium hidroksida dan tembaga sulfat. Warna merah muda
atau merah jambu terbentuk apabila larutan protein yang diselidiki mempunyai molekul kecil, misalnya proteosa dan pepton. Warna
violet terbentuk apabila larutan protein yang diselidiki mempunyai molekul yang besar, misalnya gelatin. Reaksi biuret positif untuk
semua jenis protein dan hasil –hasil antara hidrolisisnya jika masih
mempunyai dua atau lebih ikatan peptida dan negatif untuk asam amino Sumardjo, 2008.
b. Reaksi Molisch
Larutan protein majemuk yang mempunyai radikal protetik karbohidrat,
seperti glikoprotein
atau mukoprotein,
pada pencampuran secara hati-
hati dengan larutan α-naftol dalam alkohol dan asam sulfat pekat akan terbentuk larutan berwarna violet. Pada
prosesini, glikoprotein atau mukoprotein akan mengalami hidrolisis menjadi protein sederhana dan karbohidrat. Karbohidrat yang
terbentuk dengan α-naftol dalam alkohol dan asam sulfat pekat
memberikan warna violet Sumardjo, 2008.
2.3.3 Analisis Profil Protein dengan Elektroforesis
Pemisahan protein merupakan tahap yang harus dilakukan untuk mempelajari sifat dan fungsi protein. Protein dapat dipisahkan dari protein
jenis lain atau dari molekul lain berdasarkan ukuran, kelarutan, muatan, dan afinitas ikatan Nelson, 2004. Salah satu teknik yang digunakan untuk
melihat profil protein dan menentukan bobot molekulnya menggunakan SDS-PAGE Stryer,1995.
Elektroforesis adalah suatu metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar seperti protein, fragmen DNA, RNA dll dari
campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sebuah arus listrik
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dilewatkan melalui medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu
medium misalnya agarosa, maka molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut
tergantung pada rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya Yuwono, 2008.
Kegunaan elektroforesis antara lain, 1 menentukan berat molekul, 2 mendeteksi terjadinya pemalsuan bahan, 3 mendeteksi terjadinya
kerusakan bahan seperti protein dalam pengolahan dan penyimpanan, 4 memisahkan spesies molekul yang berbeda secara kualitatif maupun
kuantitatif, yang selanjutnya masing-masing spesies dapat dianalisis, dan 5 menetapkan titik isoelektrik protein Yuwono, 2008.
2.3.4 Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis SDS-
PAGE
Salah satu jenis elektroforesis yang digunakan secara luas pada saat ini
adalah metode
sodium dodecyl
sulfate-polyacrilamide gel
electrophoresis SDS-PAGE. Pemisahan protein dengan metode SDS- PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam sampel berdasarkan
berat molekul. Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan N,N bisakrilamida. Kisi-kisi tersebut berfungsi sebagai
saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi
komponen protein. Disamping untuk menentukan berat molekul suatu protein, metode ini juga digunkan untuk memonitor pemurnian protein
Wilson dan Walker, 2000 dalam Anam, 2009
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 2. Skema SDS-PAGE
Sumber : ww2.chemistry.gatech.edu
SDS-PAGE dilakukan pada pH netral menggunakan SDS dan beta-merkaptoetanol. SDS Sodium Dodecyl Sulfat merupakan detergen
anionik, yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE
yaitu untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan
kondisi, dan menyederhanakan protein bentuk, ukuran, dan muatan. Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian struktur kompleks
protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu medan listrik Anam, 2009.
SDS-PAGE dilakukan pada medan gerak vertikal dan pembuatannya lebih sulit dibanding elektroforesis gel agarosa, karena
biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi dan membutuhkan biaya yang lebih mahal serta preparasi yang lebih lama.
SDS-PAGE dapat memisahkan protein dengan ukuran 5 – 200 kDa
Konservasi Biodiversitas Raja, 2012.
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 3. Alur Kerja SDS-PAGE
Sumber : biotech.spip.ac-rouen.fr 2.4 Teknik Sampling
2.4.1 Definisi Sampel dan Sampling
