KROMATOGRAFI KOLOM KROMATOGRAFI KOLOM KROMATOGRAFI KOLOM
7.6 KROMATOGRAFI KOLOM 7.6 KROMATOGRAFI KOLOM 7.6 KROMATOGRAFI KOLOM
Seperti halnya KLT, kromatografi kolom adalah suatu bentuk kromatografi serapan Seperti halnya KLT, kromatografi kolom adalah suatu bentuk kromatografi serapan Seperti halnya KLT, kromatografi kolom adalah suatu bentuk kromatografi serapan (adsorption chromatography). Kromatografi kolom juga disebut kromatografi elusi (adsorption chromatography). Kromatografi kolom juga disebut kromatografi elusi (adsorption chromatography). Kromatografi kolom juga disebut kromatografi elusi (elution chromatography) karena senyawa-senyawa yang terpisah dielusikan dari dalam (elution chromatography) karena senyawa-senyawa yang terpisah dielusikan dari dalam (elution chromatography) karena senyawa-senyawa yang terpisah dielusikan dari dalam kolom. Prinsip kromatografi kolom sama dengan prinsip dalam KLT, yakni senyawa- kolom. Prinsip kromatografi kolom sama dengan prinsip dalam KLT, yakni senyawa- kolom. Prinsip kromatografi kolom sama dengan prinsip dalam KLT, yakni senyawa- Seperti halnya KLT, kromatografi kolom adalah suatu bentuk kromatografi serapan Seperti halnya KLT, kromatografi kolom adalah suatu bentuk kromatografi serapan Seperti halnya KLT, kromatografi kolom adalah suatu bentuk kromatografi serapan (adsorption chromatography). Kromatografi kolom juga disebut kromatografi elusi (adsorption chromatography). Kromatografi kolom juga disebut kromatografi elusi (adsorption chromatography). Kromatografi kolom juga disebut kromatografi elusi (elution chromatography) karena senyawa-senyawa yang terpisah dielusikan dari dalam (elution chromatography) karena senyawa-senyawa yang terpisah dielusikan dari dalam (elution chromatography) karena senyawa-senyawa yang terpisah dielusikan dari dalam kolom. Prinsip kromatografi kolom sama dengan prinsip dalam KLT, yakni senyawa- kolom. Prinsip kromatografi kolom sama dengan prinsip dalam KLT, yakni senyawa- kolom. Prinsip kromatografi kolom sama dengan prinsip dalam KLT, yakni senyawa-
Dalam kromatografi kolom, penyerap dikemas dalam kolom gelas dan pelarut Dalam kromatografi kolom, penyerap dikemas dalam kolom gelas dan pelarut Dalam kromatografi kolom, penyerap dikemas dalam kolom gelas dan pelarut mengalir melewati partikel-partikel penyerap. Karena kolom gelas dapat menampung lebih mengalir melewati partikel-partikel penyerap. Karena kolom gelas dapat menampung lebih mengalir melewati partikel-partikel penyerap. Karena kolom gelas dapat menampung lebih banyak penyerap maka dibanding dengan KLT, kromatografi kolom dapat digunakan banyak penyerap maka dibanding dengan KLT, kromatografi kolom dapat digunakan banyak penyerap maka dibanding dengan KLT, kromatografi kolom dapat digunakan untuk memisahkan materi dalam jumlah yang lebih banyak, biasanya dalam skala gram. untuk memisahkan materi dalam jumlah yang lebih banyak, biasanya dalam skala gram. untuk memisahkan materi dalam jumlah yang lebih banyak, biasanya dalam skala gram.
Beberapa jenis kolom dilaboratorium diperlihatkan dalam Gambar 7.10. Beberapa Beberapa jenis kolom dilaboratorium diperlihatkan dalam Gambar 7.10. Beberapa Beberapa jenis kolom dilaboratorium diperlihatkan dalam Gambar 7.10. Beberapa kolom mempunyai pelat kaca yang berlubang-lubang kecil atau berpori-pori pada dasarnya kolom mempunyai pelat kaca yang berlubang-lubang kecil atau berpori-pori pada dasarnya kolom mempunyai pelat kaca yang berlubang-lubang kecil atau berpori-pori pada dasarnya yang berfungsi untuk menahan penyerap dalam kolom, dan keran untuk mengontrol aliran yang berfungsi untuk menahan penyerap dalam kolom, dan keran untuk mengontrol aliran yang berfungsi untuk menahan penyerap dalam kolom, dan keran untuk mengontrol aliran fasa cair yang melalui kolom. Perbandingan panjang kolom dengan diameter kolom paling fasa cair yang melalui kolom. Perbandingan panjang kolom dengan diameter kolom paling fasa cair yang melalui kolom. Perbandingan panjang kolom dengan diameter kolom paling sedikit 10:1. sedikit 10:1. sedikit 10:1.
Gambar 7.10. Kolom kromatografi Gambar 7.10. Kolom kromatografi Gambar 7.10. Kolom kromatografi
Padatan Penyerap (Adsorbent) Padatan Penyerap (Adsorbent) Padatan Penyerap (Adsorbent)
Ada dua jenis padatan penyerap yang paling umum digunakan untuk kromatografi Ada dua jenis padatan penyerap yang paling umum digunakan untuk kromatografi Ada dua jenis padatan penyerap yang paling umum digunakan untuk kromatografi kolom adalah alumina (Al kolom adalah alumina (Al kolom adalah alumina (Al 2 2 2 O O O 3 3 3 ) dan silika gel (SiO ) dan silika gel (SiO ) dan silika gel (SiO 2 2 2 ). Alumina digunakan untuk pemisahan ). Alumina digunakan untuk pemisahan ). Alumina digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik nonpolar dan semi polar, sedangkan silika gel adalah padatan senyawa-senyawa organik nonpolar dan semi polar, sedangkan silika gel adalah padatan senyawa-senyawa organik nonpolar dan semi polar, sedangkan silika gel adalah padatan penyerap yang umum digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik polar. penyerap yang umum digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik polar. penyerap yang umum digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik polar. Aktivitas alumina dan silika gel keduanya bermacam-macam, sangat tergantung pada Aktivitas alumina dan silika gel keduanya bermacam-macam, sangat tergantung pada Aktivitas alumina dan silika gel keduanya bermacam-macam, sangat tergantung pada Ada dua jenis padatan penyerap yang paling umum digunakan untuk kromatografi Ada dua jenis padatan penyerap yang paling umum digunakan untuk kromatografi Ada dua jenis padatan penyerap yang paling umum digunakan untuk kromatografi kolom adalah alumina (Al kolom adalah alumina (Al kolom adalah alumina (Al 2 2 2 O O O 3 3 3 ) dan silika gel (SiO ) dan silika gel (SiO ) dan silika gel (SiO 2 2 2 ). Alumina digunakan untuk pemisahan ). Alumina digunakan untuk pemisahan ). Alumina digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik nonpolar dan semi polar, sedangkan silika gel adalah padatan senyawa-senyawa organik nonpolar dan semi polar, sedangkan silika gel adalah padatan senyawa-senyawa organik nonpolar dan semi polar, sedangkan silika gel adalah padatan penyerap yang umum digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik polar. penyerap yang umum digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik polar. penyerap yang umum digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik polar. Aktivitas alumina dan silika gel keduanya bermacam-macam, sangat tergantung pada Aktivitas alumina dan silika gel keduanya bermacam-macam, sangat tergantung pada Aktivitas alumina dan silika gel keduanya bermacam-macam, sangat tergantung pada
Alumina perdagangan tersedia dalam kondisi asam, netral, atau basa. Secara normal, silika gel sedikit bersifat asam. Senyawa-senyawa basa teradsorbsi paling kuat pada padatan penyerap asam, dan senyawa-senyawa asam paling kuat teradsorbsi pada padatan penyerap basa. Jika suatu senyawa adalah asam kuat atau basa kuat maka pemisahan yang paling baik terjadi pada padatan penyerap yang sifat asamnya atau basanya hampir sama. Padatan penyerap yang sifatnya berlawanan dengan senyawa, dapat mengabsorbsi senyawa dengan cukup kuat.
Asam atau basa dapat mengkatalis reaksi-reaksi kimia seperti hidrolisis ester, isomerisasi ofelin, dan reaksi kondensasi aldehida dan keton. Oleh karena itu, senyawa yang rentan terhadap reaksi ini harus dikromatografi pada suatu padatan penyerap yang tidak akan menimbulkan reaksi-reaksi tersebut.
Pelarut Pengelusi
Pelarut pengelusi yang digunakan untuk kromatografi kolom adalah sama dengan yang digunakan untuk KLT (lihat Tabel 7.2). Semakin polar pelarut yang digunakan semakin cepat pula semua komponen-komponen dalam campuran dalam campuran bermigrasi melalui kolom. Rendah atau tidak adanya pemisahan komponen-komponen nonpolar dari suatu campuran dapat terjadi bila digunakan pelarut polar. Pada sisi lain, bila pelarut nonpolar digunakan untuk mendapatkan pemisahan optimum senyawa-senyawa nonpolar maka komponen-komponen polar dalam campuran tidak akan terelusikan. Untuk menyelesaikan masalah semacam itu dan untuk mencapai pemisahan yang optimum senyawa polar dan senyawa nonpolar dalam suatu campuran, komposisi pelarut yang melewati kolom dapat diubah secara bertingkat ke pelarut yang lebih polar dengan cara menaikkan komposisi pelarut yang lebih polar dalam suatu campuran dua pelarut (gradient elution). Sebagai alternatif, dibuat langkah-langkah perubahan komposisi pelarut untuk memperoleh pemisahan yang optimum.
Pemilihan sistem pelarut untuk pemisahan suatu campuran dengan kromatografi kolom didasarkan atas studi sistematis analisis pelarut pemisahan campuran dengan KLT. Meskipun demikian, hasil yang diperoleh dari KLT dimungkinkan tidak langsung diterapkan dalam kromatografi kolom. Hal ini karena kromatografi kolom umumnya memberikan pemisahan yang rendah daripada yang dilakukan dengan KLT. Suatu langkah Pemilihan sistem pelarut untuk pemisahan suatu campuran dengan kromatografi kolom didasarkan atas studi sistematis analisis pelarut pemisahan campuran dengan KLT. Meskipun demikian, hasil yang diperoleh dari KLT dimungkinkan tidak langsung diterapkan dalam kromatografi kolom. Hal ini karena kromatografi kolom umumnya memberikan pemisahan yang rendah daripada yang dilakukan dengan KLT. Suatu langkah
Tabel 7.4. Urutan Kenaikan Kekuatan Elusi Pelarut Murni dan Campuran Pelarut Metanol
Etanol 1-Propanol Tetrahidrofuran Etil asetat Etil eter-metanol (99:1) Etil eter
t Sikloheksana-etil asetat (20:80)
ngka Dikorometana-etil eter (60:40) eni Sikloheksana-etil asetat (80:20)
Kloroform im us
Dikorometana el Benzena
n ta
Toluena Sikloheksana
ekua
Heksana
Sumber: Doyle, M. P. dan Mungall, W. L., 1980
Kolom Kromatografi
Kemasan padatan penyerap dalam kolom gelas harus merata, tanpa ada rongga udara atau retakan. Penyerap yang tidak merata dalam kolom dapat mengganggu jalannya eluen dan mencegah pemisahan yang optimum. Metode pengemasan padatan penyerap dalam kolom yang umumnya cukup berhasil adalah teknik pengemasan bubur (slurry packing technique).
Di dalam metode ini, kolom dijepit erat dengan posisi tegak dan kran tertutup. Jika kolom dilengkapi dengan pelat gelas berlubang, pasang kertas saring di atas pelat gelas tersebut. Akan tetapi jika kolom tidak dilengkapi dengan pelat gelas, masukkan glass wool. Kemudian masukkan pasir bersih ke dalam kolom sampai ketebalan 1 cm, lalu kolom diisi dengan pelarut hingga ¼ volume kolom. Pelarut dan padatan penyerap dicampur dalam gelas piala sampai membentuk bubur (slurry). Kran kolom dibuka hingga pelarut menetes ke dalam gelas Erlenmeyer. Kemudian bubur penyerap dan pelarut dituang ke dalam Di dalam metode ini, kolom dijepit erat dengan posisi tegak dan kran tertutup. Jika kolom dilengkapi dengan pelat gelas berlubang, pasang kertas saring di atas pelat gelas tersebut. Akan tetapi jika kolom tidak dilengkapi dengan pelat gelas, masukkan glass wool. Kemudian masukkan pasir bersih ke dalam kolom sampai ketebalan 1 cm, lalu kolom diisi dengan pelarut hingga ¼ volume kolom. Pelarut dan padatan penyerap dicampur dalam gelas piala sampai membentuk bubur (slurry). Kran kolom dibuka hingga pelarut menetes ke dalam gelas Erlenmeyer. Kemudian bubur penyerap dan pelarut dituang ke dalam
Dalam pengemasan kolom, tinggi pelarut harus dijaga agar tetap diatas permukaan Dalam pengemasan kolom, tinggi pelarut harus dijaga agar tetap diatas permukaan Dalam pengemasan kolom, tinggi pelarut harus dijaga agar tetap diatas permukaan padatan penyerap. Seperempat bagian kolom pada bagian atas (puncak) biasanya tidak diisi padatan penyerap. Seperempat bagian kolom pada bagian atas (puncak) biasanya tidak diisi padatan penyerap. Seperempat bagian kolom pada bagian atas (puncak) biasanya tidak diisi dengan padatan penyerap. Hal ini dimaksudkan untuk dijadikan penampung pelarut. Pada dengan padatan penyerap. Hal ini dimaksudkan untuk dijadikan penampung pelarut. Pada dengan padatan penyerap. Hal ini dimaksudkan untuk dijadikan penampung pelarut. Pada saat kolom sudah terisi dengan padatan penyerap dengan ketinggian yang diinginkan, saat kolom sudah terisi dengan padatan penyerap dengan ketinggian yang diinginkan, saat kolom sudah terisi dengan padatan penyerap dengan ketinggian yang diinginkan, pelarut dialirkan dari kolom hingga tinggi cairan hanya mencapai permukaan padatan pelarut dialirkan dari kolom hingga tinggi cairan hanya mencapai permukaan padatan pelarut dialirkan dari kolom hingga tinggi cairan hanya mencapai permukaan padatan penyerap. Sekarang kemasan kolom sudah siap digunakan. penyerap. Sekarang kemasan kolom sudah siap digunakan. penyerap. Sekarang kemasan kolom sudah siap digunakan.
Penempatan Contoh ke Dalam Kolom Penempatan Contoh ke Dalam Kolom Penempatan Contoh ke Dalam Kolom
Di dalam prosedur yang digunakan untuk kromatografi kolom, campuran yang akan Di dalam prosedur yang digunakan untuk kromatografi kolom, campuran yang akan Di dalam prosedur yang digunakan untuk kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan dilarutkan ke dalam sesedikit mungkin pelarut yang sesuai (maksimum volume dipisahkan dilarutkan ke dalam sesedikit mungkin pelarut yang sesuai (maksimum volume dipisahkan dilarutkan ke dalam sesedikit mungkin pelarut yang sesuai (maksimum volume pelarut yang digunakan untuk melarutkan contoh harus tidak lebih dari 1/20 volume pelarut yang digunakan untuk melarutkan contoh harus tidak lebih dari 1/20 volume pelarut yang digunakan untuk melarutkan contoh harus tidak lebih dari 1/20 volume kemasan kolom). Jika total campuran tidak larut dalam pelarut sejumlah itu, maka dapat kemasan kolom). Jika total campuran tidak larut dalam pelarut sejumlah itu, maka dapat kemasan kolom). Jika total campuran tidak larut dalam pelarut sejumlah itu, maka dapat ditambahkan sedikit pelarut polar. Dengan bantuan pipet, larutan campuran dipindahkan ke ditambahkan sedikit pelarut polar. Dengan bantuan pipet, larutan campuran dipindahkan ke ditambahkan sedikit pelarut polar. Dengan bantuan pipet, larutan campuran dipindahkan ke atas puncak padatan penyerap dalam kolom (Gambar 7.11). atas puncak padatan penyerap dalam kolom (Gambar 7.11). atas puncak padatan penyerap dalam kolom (Gambar 7.11).
Gambar 7.11. Prosedur untuk kromatografi kolom Gambar 7.11. Prosedur untuk kromatografi kolom Gambar 7.11. Prosedur untuk kromatografi kolom
Kran pada dasar kolom dibuka dan pelarut mengalir keluar sampai tinggi larutan Kran pada dasar kolom dibuka dan pelarut mengalir keluar sampai tinggi larutan Kran pada dasar kolom dibuka dan pelarut mengalir keluar sampai tinggi larutan contoh dalam kolom hanya mencapai puncak padatan penyerap. Dengan sangat hati-hati, contoh dalam kolom hanya mencapai puncak padatan penyerap. Dengan sangat hati-hati, contoh dalam kolom hanya mencapai puncak padatan penyerap. Dengan sangat hati-hati, cuci sisa contoh yang menempel pada puncak kolom dengan menggunakan pelarut segar cuci sisa contoh yang menempel pada puncak kolom dengan menggunakan pelarut segar cuci sisa contoh yang menempel pada puncak kolom dengan menggunakan pelarut segar Kran pada dasar kolom dibuka dan pelarut mengalir keluar sampai tinggi larutan Kran pada dasar kolom dibuka dan pelarut mengalir keluar sampai tinggi larutan Kran pada dasar kolom dibuka dan pelarut mengalir keluar sampai tinggi larutan contoh dalam kolom hanya mencapai puncak padatan penyerap. Dengan sangat hati-hati, contoh dalam kolom hanya mencapai puncak padatan penyerap. Dengan sangat hati-hati, contoh dalam kolom hanya mencapai puncak padatan penyerap. Dengan sangat hati-hati, cuci sisa contoh yang menempel pada puncak kolom dengan menggunakan pelarut segar cuci sisa contoh yang menempel pada puncak kolom dengan menggunakan pelarut segar cuci sisa contoh yang menempel pada puncak kolom dengan menggunakan pelarut segar
5 mL/ menit dari kolom yang berdiameter-dalam 2 cm, dan bahkan fraksi yang lebih besar dapat terkumpul pada kecepatan alir yang lebih cepat dari kolom yang berdiameter-dalam lebih besar.
Karena perbedaan kepolaran maka komponen-komponen contoh berimigrasi melalui kolom dengan kecepatan yang berbeda-beda, sehingga komponen-komponen contoh terpisah dan terkumpul pada fraksi eluat yang berbeda. Masing-masing fraksi dipekatkan dengan evaporasi. Larutan pekat yang dihasilkan dianalisis dengan KLT untuk menentukan komposisi materi dalam fraksi. Selanjutnya fraksi yang mengandung komponen murni yang sama digabung, dan komponen tersebut telah terisolasi.