Tempat dan Waktu Unjuk Kerja Instrumen GC-FID

Gambar 3.1 Tahapan penelitian

3.3.1 Tahap Persiapan

3.3.1.1 Penyiapan Bahan Penyiapan bahan dilakukan dengan menyiapkan baku induk stiren dan baku internal dengan konsentrasi masing-masing 1000 µgmL. Larutan baku induk stiren 1000 µgmL dibuat dengan menimbang 25 mg stiren, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan tambahkan heptana sampai tanda batas. Larutan baku internal 1000 µgmL juga dibuat sama dengan larutan baku stiren yaitu 25 mg 1,2,4,5-Tetrametilbenzenakemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25mL dan tambahkan heptana sampai tanda batas. Tahap 1. Persiapan Tahap 3. Validasi Metode Analisis Tahap 2. Orientasi Prosedur Uji Penyiapan Bahan : Larutan baku induk stiren dan baku internal Pengecekan unjuk kerja instrumen GC-FID : − Linieritas − Presisi − LOD dan LOQ Analisis kandungan spesifik total residu monomer stiren pada sampel 3 kali Persiapan sampel polistiren − Selektivitas − Linieritas − Akurasi − Presisi − LOD dan LOQ 3.3.1.2 Pengecekan unjuk kerja instrumen GC-FID Pengecekan unjuk kerja instrumen GC-FID merupakan orientasi awal bahwa GC-FID dapat digunakan untuk mendeteksi stiren dengan kondisi dan parameter tertentu. Untuk mengetahui bahwa instrumen GC-FID tersebut dapat digunakan maka ditentukan kurva linearitas dan presisi dengan persyaratan yang telah ditetapkan. Dalam menentukan linieritas instrumen, dibuat larutan baku kerja dengan 5 lima konsentrasi yang berbeda dari pengenceran larutan baku induk stiren 1000 µgmL. Konsentrasi larutan baku kerja tersebut berturut-turut 1 µgmL, 2 µgmL, 5 µgmL, 10 µgmL dan 20µgmL. Masing-masing konsentrasi dibuat dengan memipet 10 µL, 20 µL, 50 µL, 100 µL dan 200 µL dari larutan baku induk stiren, ditambah larutan baku internal 50 µL dari larutan baku internal induk, kemudian ditambah heptana hingga tanda batas 10 mL dalam labu takar 10 mL konsentrasi baku internal sekitar 5 µgmL dan dianalisis ke GC-FID sebanyak tiga kali triplo . Kurva linieritas y = ax + b untuk unjuk kerja instrumen merupakan hubungan antara konsentrasi baku kerja stiren dengan rasio luas area stiren dan baku internal. Kondisi dan parameter GC-FID yang digunakan mengacu pada EU project PIRA 2003 untuk kondisi suhu oven dan jenis kolom dimodifikasi dengan penelitian Paraskevopoulou 2011 untuk suhu detektor dan injektor seperti pada Tabel 3.1. LOD dan LOQ instrumen diperoleh dari percobaan linearitas instrumen tetapi yang diukur adalah rasio signal to noise SN dari respon GC-FID untuk masing-masing konsentrasi yang berbeda. Selanjutnya besarnya rasio SN tersebut diplotkan terhadap konsentrasi, dan dibuat persamaan kurva linier: y = ax + b. Berdasarkan kurva tersebut, kemudian dihitung nilai LOD adalah nilai x pada SN= 3.00, sedangkan nilai LOQ adalah nilai x pada SN=10.00.

3.3.2 Tahap Orientasi Prosedur Uji

3.3.2.1 Persiapan sampel kemasan polistiren dan uji kandungan spesifik monomer stiren Sampel kemasan kosong polistiren busa bentuk gelas pada bagian yang tidak mengandung tinta pewarna dipotong kecil dengan ukuran ± 0.50 × 0.50 cm 2 , kemudian ditimbang sebanyak ± 0.50 gram dalam gelas beaker 250 mL. Larutan simulan pangan dibuat dengan mencampurkan baku internal 250 µL dari baku internal induk 1024 µgmL dan pelarut heptana sebagai simulan pangan hingga tanda batas 50 mL dalam labu ukur. Larutan simulan pangan tersebut kemudian dituangkan ke dalam gelas beaker 250 mL dan dimasukkan ke dalam waterbath pada 49 o C. Setelah sekitar 10 menit larutan simulan sudah mencapai suhu 49 o C ukur dengan termometer untuk memastikan, kemudian dituangkan ke dalam gelas beaker yang berisi sampel polistiren, tutup dengan gelas arloji dengan diameter hampir sama dengan diameter gelas beaker, sehingga sampel dalam keadaan terendam sempurna dalam larutan simulan pangan. Gelas beaker tersebut kemudian ditutup dengan menggunakan cawan petri yang berdiameter lebih besar daripada diameter gelas beaker dan segera dimasukkan ke dalam waterbath pada 49 o C suhu selama 15 menit seperti pada Tabel 2.3. Kemudian sampel dipisahkan dari larutan simulan pangan. Larutan simulan pangan ini kemudian disebut larutan uji. Persiapan larutan uji tersebut dilakukan sebanyak 3 ulangan. Tabel 3.1 Kondisi dan parameter GC-FID yang digunakan 3.3.2.2 Analisis konsentrasi stiren dalam sampel dari larutan uji Larutan uji dianalisis dengan GC-FID sebanyak 2 dua kali analisis. Luas area stiren dari larutan uji digunakan untuk menghitung konsentrasi stiren dalam larutan sampel, menggunakan persamaan kurva linieritas dari hasil unjuk kerja instrumen. Lakukan 3 ulangan triplo. Konsentrasi stiren dalam sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

3.3.3 Tahap Validasi Metode Uji

3.3.3.1 Selektivitas Selectivity Selektivitas dilakukan dengan membuat larutan sampel kemasan polistiren dalam pelarut heptana, larutan sampel kemasan polistiren dengan penambahan baku internal dalam pelarut heptana dan larutan sampel kemasan polistiren dengan penambahan baku stiren dan baku internal dalam pelarut heptana. Kemudian ke 3 tiga larutan tersebut dianalisis dengan GC-FID dan hasil kromatogramnya dibandingkan. Selektivitas metode analisis dinyatakan baik jika puncak senyawa stiren maupun baku internal terpisah dengan baik dan kedua puncak tersebut tidak diganggu dengan puncak senyawa cemaran dalam sampel yang terdeteksi dalam kromatogram. Kolom Rtx-5 fused-silica column, 30 m x 0,25 mm ID, ketebalan film 0,25 µm R Varian Split ratio 1:10 setelah 5 menit Suhu oven 40°C selama 2 menit pertama kemudian meningkat 10°Cmenit hingga 80°C, 20°Cmenit hingga suhu akhir 180°C dan pertahankan selama 1 menit Gas pembawa, aliran gas Helium, 14 mLmenit Aliran udara 400 mLmenit Aliran hidrogen 40 mLmenit Volume Injeksi 1 µL Suhu FID 250°C. Suhu injector 230ºC = Konsentrasi stiren dalam sampel µgg Konsentrasi persamaan kurva Berat sampel x Faktor pengenceran x volume larutan sampel 3.3.3.2 Linieritas Linearity Kurva liniearitas metode diperoleh dari analisis larutan baku kerja stiren dengan perlakuan sama seperti larutan uji yaitu perendaman waterbath pada 49 o C selama 15 menit. Larutan baku kerja stiren dibuat dengan 6 konsentrasi baku kerja stiren yang berbeda yaitu 5 konsentrasi sesuai dengan konsentrasi untuk kurva linieritas unjuk kerja instrumen 1 µgmL, 2 µgmL, 5 µgmL, 10 µgmL, 20 µgmL dan 1 konsentrasi di bawah hasil pengukuran sampel pada tahap orientasi prosedur uji yaitu 0.50 µgmL. Dalam baku kerja tersebut masing- masing mengandung baku internal dengan konsentrasi 5 µgmL. Kurva linieritas metode dibuat dengan memplotkan rasio area stiren dan baku internalnya sebagai sumbu y terhadap konsentrasi stiren sebagai sumbu x, sehingga diperoleh persamaan linier y = ax + b. Persyaratan linieritas untuk metode analisis adalah mempunyai R 2 0.990 atau r 0.995 AOAC 2012. 3.3.3.3 Presisi Precision Penentuan presisi metode dilakukan dengan melakukan analisis kadar stiren pada larutan uji sebanyak 7 tujuh ulangan dan analisis dengan GC-FID masing- masing dilakukan 2 kali. Konsentrasi stiren dalam sampel ditentukan dari kurva linieritas metode kemudian ditentukan nilai rata-rata konsentrasinya dan nilai RSD-nya. Persyaratan presisi metode adalah mempunyai nilai RSD sampel 23 x RSD Horwitz. 3.3.3.4 Akurasi Accuracy Penentuan akurasi metode ditentukan dari pengujian seperti untuk penentuan presisi, namun selain larutan juga ditambahkan larutan baku stiren 250 µL dari baku stiren induk kemudian ditambahkan heptana hingga 50 mL. Pembuatan larutan tersebut dilakukan 7 tujuh ulangan, dan analisis dengan GC- FID sebanyak 2 dua kali. Konsentrasi stiren dihitung dengan menggunakan kurva linieritas stiren metode. Perbandingan nilai konsentrasi stiren yang terukur setelah dikurangi dengan konsentrasi dalam sampel dengan konsentrasi baku stiren yang ditambahkan merupakan recovery, dengan rumus sebagai berikut : Persyaratan recovery berdasarkan AOAC 2012 pada konsentrasi sekitar 100 µgg adalah 85–110 . 3.3.4.5 LOD dan LOQ Diperoleh dari kurva linearitas validasi metode uji, dengan prinsip perhitungan seperti pada penentuan LOD dan LOQ alat. Recovery = Konsentrasi hasil pengukuran - konsentrasi sampel Konsentrasi baku standar yang ditambahkan x 100 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Unjuk Kerja Instrumen GC-FID

Unjuk kerja instrumen GC-FID dilakukan sebelum pengukuran konsentrasi stiren, untuk memastikan bahwa instrumen GC-FID dapat digunakan dengan memberikan hasil kromatogram yang baik dan sesuai dengan tujuan analisis. Unjuk kerja instrumen yang dilakukan terdiri dari penentuan linieritas, presisi dan LOD LOQ. Sebelum melakukan linieritas, maka terlebih dahulu mengetahui profil kromatogram dari pelarut heptana, baku stiren dari beberapa konsentrasi dan baku internal. Profil kromatogram dari pelarut yaitu heptana penting untuk mengetahui puncak yang ada dalam pelarut heptana atau cemarannya sebelum penambahan baku stiren dan baku internal. Profil kromatogram baku stiren dan baku internal untuk mengetahui dan memastikan ketepatan waktu retensi dari puncak yang dihasilkan. Berdasarkan kromatogram yang dihasilkan, waktu retensi Rt dari baku stiren sekitar menit ke 7 dan waktu retensi Rt dari baku internal 1,2,4,5- tetrametilbenzena menit ke 10. Dalam penentuan linieritas dilakukan dengan membuat baku kerja beberapa konsentrasi yang diperoleh dari baku induk stiren dan penambahan baku internal dengan konsentrasi tetap. Perhitungan konsentrasi baku induk stiren, baku internal dan baku kerja seperti pada Lampiran 1. Hasil profil kromatogram baku kerja linieritas instrumen seperti pada Lampiran 2, sedangkan hasil pengukuran luas area baku kerja dan baku internal seperti pada Lampiran 3. Kemudian dihitung persamaan regresi kurvanya dengan menplotkan antara rata-rata rasio luas area stiren dan baku internal sumbu Y dan konsentrasi baku kerja sumbu X seperti pada Tabel 4.1. Hasil perhitungan statistik kurva memberikan niai R 2 = 0.999 dengan persamaan linieritas y= 0.206x - 0.001. Nilai R 2 = 0.999 memenuhi syarat kriteria linieritas instrumen. Kurva linieritas seperti pada Gambar 4.1. Tabel 4.1 Konsentrasi baku kerja dan rasio area stiren dan baku internal pada uji linieritas unjuk kerja instrumen GC-FID Baku kerja Konsentrasi Baku kerja µgmL Sumbu X Rasio area Sumbu Y Baku kerja 1 1.00 0.21 Baku kerja 2 2.01 0.39 Baku kerja 3 5.02 1.05 Baku kerja 4 10.04 2.08 Baku kerja 5 20.08 4.13 Gambar 4.1 Kurva linieritas instrumen GC-FID untuk pengukuran larutan standar stiren dengan baku internal 1,2,4,5- tetrametilbenzena pada unjuk kerja instrumen Berdasarkan Tabel 4.2 tersebut nilai RSD waktu retensi dan luas area dari stiren adalah 0.01 dan 0.61 , sedangkan baku internal 0.01 dan 0.45 . Nilai RSD waktu retensi dan area stiren dan baku internal tersebut memenuhi persyaratan presisi instrumen sebesar 2.0 menurut JECFA 2006 Tabel 4.2 Nilai presisi RSD hasil unjuk kerja instrumen dari stiren dan baku internal Pengulangan Stiren Baku internal Waktu retensi Rt Luas area Waktu retensi Rt Luas area 1 7.01 13039 10.00 12607 2 7.01 12936 10.00 12615 3 7.01 12917 10.00 12702 4 7.01 12978 10.00 12601 5 7.01 12796 10.00 12640 6 7.01 12875 10.00 12651 7 7.01 12975 10.00 12758 Rata-rata SD RSD 7.01 0.00 0.01 12931 78.86 0.61 10.00 0.00 0.01 12654 57.28 0.45 Limit of Detection LOD dan Limit of Quantification LOQ dari instrumen ditentukan untuk mengetahui batas minimal yang dapat terdeteksi maupun yang terkuantisasi pada instrumen GC-FID dalam kondisi yang sudah ditentukan. Penentuan LOD dan LOQ pada penelitian ini adalah mencari rasio signal terhadap noise SN dari kromatogram baku kerja yang digunakan pada saat menentukan linieritas instrumen. Nilai SN ditentukan pada instrumen GC-FID seperti pada Tabel 4.3. Kemudian nilai tersebut diplotkan dengan konsentrasi baku kerja dan diperoleh persamaan linieritas y = 7.500x - 0.015, dengan nilai R 2 = 0.999 seperti pada Lampiran 4. Berdasarkan persamaan tersebut kemudian dihitung konsentrasi LOD, dengan SN= 3.00 sebagai sumbu Y dan konsentrasi LOQ dengan SN= 10.00, seperti pada lampiran 4. Hasil perhitungan diperoleh LOD instrumen = 0.4 µgmL dan LOQ instrumen = 1.34 µgmL. Hasil uji unjuk kerja instrumen GC- FID secara lengkap dapat dilihat pada Tabel 4.4. Tabel 4.3 Nilai rasio signal dan noise pada unjuk kerja instrumen GC-FID Baku kerja Konsentrasi baku kerja µgmL Rasio signal dan noise SN Baku kerja 1 1.00 8.90 Baku kerja 2 2.01 13.22 Baku kerja 3 5.02 37.25 Baku kerja 4 10.04 76.53 Baku kerja 5 20.08 150.19 Tabel 4.4 Hasil uji unjuk kerja instrumen GC-FID untuk analisis kandungan spesifik residu total monomer stiren

4.2 Orientasi prosedur uji

Orientasi prosedur uji dilakukan untuk menentukan tahapan prosedur uji yang paling sederhana dan praktis untuk menentukan kandungan spesifik monomer stiren pada sampel. Orientasi prosedur uji pada penelitian ini mengacu pada Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.03.1.23.07.11.6664 Tahun 2011 tentang Pengawasan Kemasan Pangan, yaitu sesuai Tabel 2.3 prosedur pengujian dan simulan pangan yang digunakan. Prosedur pengujian yang dipilih pada penelitian ini adalah kondisi C yaitu pengisian panas atau pasteurisasi diatas 66 °C, sesuai dengan kondisi penggunaan sampel yang dipilih, yaitu penggunaan panas seperti pada Tabel 2.3. Unjuk Kerja Instrumen GC-FID Hasil Persyaratan Linieritas y = ax +b y= 0.206x - 0.001, R 2 = 0.999 R 2 0.990 AOAC 2012 Presisi RSD − Stiren : RSD waktu retensi = 0.01 , RSD luas area = 0.61 − Baku internal : RSD waktu retensi = 0.01 , RSD luas area = 0.45 RSD 2.0 JECFA 2006 LOD dan LOQ LOD = 0.40 µgmL LOQ = 1.34 µgmL - Pada kondisi pengujian tersebut pelarut simulan pangan yang digunakan adalah air dan heptana. Pada penelitian ini dibatasi hanya dengan pelarut heptana, dengan pertimbangan pelarut heptana merupakan kondisi terburuk dibanding dengan pelarut air dalam hal ekstraksi monomer stiren. Prosedur pengujian dengan menggunakan simulan heptana tersebut dilakukan pada suhu 49 °C selama 15 menit Tabel 2.3. Berdasarkan hal tersebut, dalam penelitian ini ditentukan tahapan mulai dari preparasi sampel sampai pengukuran larutan uji sampel dengan menggunakan kromatografi gas dengan pendeteksi ionisasi nyala. Kondisi kromatografi gas merupakan hal yang paling penting dalam penelitian ini, karena dengan kondisi kromatografi gas yang sesuai maka dapat menghasilkan kromatogram yang dapat diukur secara kuantitatif. Tahapan pengujian dilakukan sesuai bagian 3.3.2.1. dan 3.3.2.2 sebanyak 3 tiga kali ulangan, dengan penimbangan cuplikan sampel masing-masing adalah 0.4999 gram, 0.5001 gram dan 0.4998 gram. Hasil dari orientasi uji diperoleh luas area stiren dan baku internal dalam sampel, kemudian dihitung konsentrasi stiren dalam kurva dengan menggunakan kurva persamaan linieritas instrumen y = 0.206x – 0.001 dan dihitung konsentrasi stiren dalam sampel seperti pada Lampiran 5. Konsentrasi stiren dalam sampel tersebut masing-masing adalah 92.61 µgg, 91.10 µgg dan 100.14 µgg dengan rata-rata konsentrasi 94.63 ± 4.73 µgg sampel. Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.03.1.23.07.11.6664 Tahun 2011 tentang Pengawasan Kemasan Pangan, batas migrasi spesifik stirena tidak ditetapkan. Dalam peraturan tersebut persyaratan yang ditetapkan adalah kandungan spesifik total residu monomer stiren adalah 1.0 berat atau 10000 µgg dan 0.5 berat atau 5000 µgg, sehingga untuk menentukan keamanan suatu kemasan pangan polistiren perlu dihitung nilai asupan harian atau paparan monomer stirena, kemudian hasilnya dibandingkan terhadap nilai [Provisional Asupan Harian Maksimum yang Ditoleransi Provitional Maximum Tolerable Daily Intake PMTDI] yang ditetapkan oleh Joint FAOWHO Expert Committee on Food Additives tahun 1984, untuk stiren sebesar 0.04 mgkg berat badanhari. Perhitungan asumsi paparan sebagai berikut. Asumsi paparan monomer stiren : Misalkan setiap hari perorang konsumsi 3 cup mi instan, berat kemasan polistiren cup mini kemasan tersebut 5 gram, sehari jumlah kemasan polistiren cup 15 gram 0.015 kg. Rata-rata total residu monomer stiren hasil percobaan adalah 94.63 µgg sampel 94.63 mgkg sampel merupakan hasil perendaman dua sisi dari kemasan two side contact. Untuk menghitung paparan, sesuai dengan kondisi nyata yaitu kemasan kontak satu sisi dengan pangan one side contact, sehingga kadar monomer stiren diperkirakan menjadi setengah dari 94.63 mgkg sampel yaitu 47.31 mgkg sampel. Dengan berat badan konsumen rata-rata 55.5 kg Badan POM 2011. Paparan per hari Σ kadar zat kimia dalam kemasan pangan x konsumsi per hari Berat badan = Paparan per hari 47.31 mgkg kemasan pangan x 0.015 kghari 55.5 kg berat badan =